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自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作,最近看了一篇相关方面的文献,在这里与大家分享下!同时也有以下疑问想下大家请教下,欢迎拍砖!!!
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题目:Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors 杂志:Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高,但文章质量还不错,如十几年前 cell 下面的 stem cell, 文章作者为KIM,参考文献中有他的三篇一作SCI论文,推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作;这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的,且只有四个作者,还要除去一个通讯作者,文章详见附件!!!
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- N/ V8 R/ A: b4 s% I# R- D$ }一. 文章的结构:8 N" O" v4 o. ~ N
1. 蛋白的制备分为A、B两组:( s+ Z7 I- [+ S# r5 l& C, B1 M
A组: Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc和Nanog(OSKMN) 的编码区亚克隆至Pet28a载体中,同时加上MTD(使重组蛋白入核), HIS-TAG(利于纯化), NLS(核定位序列)等序列,获得重组蛋白; 可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化,OSKMN的表达量不高,且是包涵体表达;在此基础上,想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白,于是有了B组。
- |0 a3 G* r" s ~! sB组: ,对OSKML进行了基因优化,同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是,好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。- W' ?" _" V0 b6 G4 s. a1 x0 o; l
, h) i/ e) ]/ w5 H/ o6 `
2. A组重组蛋白介导的重编程(hES培养体系):有两种方法:A组:诱导全过程中添加蛋白;B组:间断添加蛋白( ^) P) n% Y5 B8 j$ k6 U5 Y( [
考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象,且Nanog溶解度最低,于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
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, s- G, W/ T0 \! n! e3. B组重组蛋白介导的重编程(偏重于mES培养体系):也有两中种方法:A组:无Vc 加Lif 诱导,B组:有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比' P7 g& a& i. M, S4 D
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二. 总结7 o$ X5 E$ [8 T3 w) R X- D
1. 文章结构紧凑,一环套一环,能相互对比,也能在各组别之间对比,这样讨论的东西就比较多,同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
9 s; Z7 Z Z: Z% L2. 文章写的比较诚恳,不夸大,不浮躁,如只得到了部分重编程的干细胞,得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
" _/ O$ x) U6 ~ x$ c3. 文章讨论部分: A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题,这是以前文章中没有提到的; B. 还提到了 加入蛋白三天后,就出现了克隆,他们感觉与其他重编程相比,这个出克隆的时间太快了,不利于细胞的充分重编程,就如一个人跑的太快了容易摔倒,这暗示我们应该降低这个过程,如降低蛋白的浓度,改变因子加入的顺序(c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡)。- ?* i4 E1 V- v9 r& K, c: |
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三. 疑问
* O0 F1 D$ L3 r2 g; T5 }! b1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的,这些MTD与以前的TAT,9R,11R 又有何种优势???自己不是很了解,请高手指点
/ y+ o2 f& ?6 \ f4 [' q$ Y+ f2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明,文章中只有一张SDS-PAGE图片,并且没有WB图片,虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性5 M8 a6 l. {/ a* t4 ]! V# ^6 e1 F
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢,这与2012年张慧的文章结果是相似的,他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系 对于这一问题大家怎么看???+ f1 z1 d! C' _* [7 y
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白,然后介导猪的体细胞重编程!!! 这方面的工作现在也比较多了,套路都差不多,大家能帮我想想还有什么地方,还可以做哪些创新,以便于将来发好文章。
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: e) o, |0 _" k r' I欢迎讨论,自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章!!!! h, G1 g* h6 K6 ]1 I
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& b+ {$ l; ~* H: ~补充内容 (2014-3-29 22:10):% f; f; T1 P1 U/ k6 [) b6 p
关于蛋白质介导体细胞重编程:( D; n) O) X& L$ q2 o' Y
1. 蛋白的可溶性与否,这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本;
9 e \' J4 V9 i' _, A2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度,如蛋白与细胞共孵育一段时间后,蛋白析出的问题!9 C2 j2 D9 a h5 [; j. ^
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补充内容 (2014-3-29 22:16):
$ G1 k% k4 M% R, F$ `3. 蛋白添加的顺序也应该优化,最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章(2013.10,月份记不清了),其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的,如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序,是否会出现能增值的克隆呢??+ z0 b' B7 N) N* H$ Q
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补充内容 (2014-4-6 14:55):' F% J" o6 M# @6 g5 C
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章,文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上(2013年见刊),有中国农业大学的Ying完成,技术是实验室的常规技术,但文章的起点不错,有创新性! |
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