2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ ; |" X1 g6 Z- k7 m1 `$ @
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一. 文章的结构：) f7 Y7 \2 h; G- l# I
1. 蛋白的制备分为A、B两组：4 j5 [; u' X- _' D8 `
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。+ f, ]0 Q5 W1 \$ F! ]
B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
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# ~: D7 H7 @/ k* ]2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
; i" s& M% R/ g+ M7 r5 {5 _考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
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. h' M  Q) ^1 ?  k& C8 @3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比, g! U" K% ?. J

+ s7 Y, Y3 ^3 l" t二. 总结* g( d* q: {1 k" @4 t! o. c
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
- Z* C+ k6 f3 J$ A6 k2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
' u6 l+ o2 y, K3 k( O3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。1 v. L* R" H! p/ u" P6 P

  _7 r" {( r7 Q1 R8 g三. 疑问
8 ?! l8 v: c) v3 p& a1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点6 y% u/ E- G( ^/ F
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性; A. {5 L% L' S4 \. k( a  b6 g
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？" X- V& h6 V& Y( E, C
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   
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欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！
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! s' B7 i  L  s- Z  h( y% E) N! _- F. ]
补充内容 (2014-3-29 22:10):
2 ~' u# i) N- h8 n: A9 k关于蛋白质介导体细胞重编程:$ b# f, w/ c/ u/ ^5 l& w4 B
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；1 m( Q7 g8 ^$ X1 ^
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！$ i, q3 r: B" W/ D: v! N/ O
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补充内容 (2014-3-29 22:16):; {& g' \0 Z5 B6 t
3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？
8 P5 L" O' \; r8 }: p( h, N7 R
2 S: |" x3 v; h2 N/ ?5 ^; P( }$ \6 S) Y0 m* B, a
补充内容 (2014-4-6 14:55):4 A$ T; i+ Y( q( B" y3 r
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

Andyhigh

Damon-Salvatore

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：
2 H3 H' S1 c; G2 o) s! q* `  {7 [5 q* u+ P

8 b+ x( R, [( x" Q2 }7 z补充内容 (2014-3-29 08:45):
5 i; ]; v$ X4 o剩余的希望大家多多指点

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子9 P3 @. Y+ f( }5 d' S1 v  d1 V- z

: t! X' I. [% q2 @" V% Q2 o% }这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

Damon-Salvatore

回复 Andyhigh 的帖子7 h4 s0 B4 m# N8 h' R' M$ ^# v0 t
3 M9 Y9 u: ~3 e* }# D
嗯 现在大三。前辈现在在什么单位呢？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子6 V* l  S; S6 W  X4 P, Q  o' {) k1 \

7 @' e' W% L! ~0 M在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子* ?% R5 ]& g; N, S
( V- \! r+ g! Y% L0 C# R; |, G
第34届国际动物遗传学大会今年七月底在 西安 举办，  这个会议你可以关注下0 O: k# V: ^# g3 H8 k; o
链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

Damon-Salvatore

回复 Andyhigh 的帖子% ?( C7 `) D8 Y' i# ~

! v/ S' h5 R. h, l3 k" a恩 谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子
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是去年在成都开会，李宁院士在会上 把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

Andyhigh

关于EMT-MET的文章：