2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！
6 K6 v- L! r/ s5 g1 ?4 d/ Z2 Z$ X7 [# i* z; P  w
一. 文章的结构：
$ \+ X+ ^- p% F/ Z; c- U1. 蛋白的制备分为A、B两组：
" y: [- Z/ i7 ^' Z, h/ pA组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
. S, y6 H0 Z& \/ B6 b0 VB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。  ?! }0 s6 }, K, a4 K

  F! T( ^  O+ B6 ?. c2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白; t) Q7 X5 D; L! A- j$ E
考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
7 v' D- U$ ?* M" G. |- |- G0 y6 S' d% R' }; U
3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比
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. Q2 ]- Q0 k* r9 U* C6 K二. 总结" u) u, E) X( G
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
0 h) a  B+ _) X* D5 T' H2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的  g& k! q$ l& D, [+ d# W1 K8 g
3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
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三. 疑问, m, ]2 n3 K2 Y! W+ O
1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点7 _! S; ]8 L6 f8 N
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
$ }% _- C6 Y2 P4 q3 M3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？, Q/ L( `' v: y
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   
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欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！
2 ?+ @1 E' H9 L5 c/ Y( z& w
( Y) Y3 ]- H, }
; q0 a0 a' u$ E) ~1 p7 I补充内容 (2014-3-29 22:10):
. K  w4 W% g* y3 S! a0 o0 h关于蛋白质介导体细胞重编程:6 O1 X0 o$ v$ R" T
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；7 m+ s9 n% a/ ~
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！! y) f( U: U' y9 o. L$ i
2 s( |, ]* D' W. y
补充内容 (2014-3-29 22:16):2 W, V. S$ N% y, Q/ @8 R' [1 }
3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？* ?5 B9 e$ {8 D* @4 B

' z  c, d- e: m$ f. {& r% F4 t6 i1 r* g* a
补充内容 (2014-4-6 14:55):2 y- T1 t# m. m5 Q& Q% n
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

xray19

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, V5 D2 \2 Q% D" J# s7 r6 |" z
权限不够，还加不了好友。有机会多就ips 聊聊

Andyhigh

回复 xray19 的帖子
' p9 }  a& V& p( V- ^1 [
) ~- k9 ?" E, ]0 t  n大鼠的ESCs及培养体系有，猪ESCs也有，但是缺乏培养体系，其他的不太确定，估计绝大部分都没有公认的培养体系。

xray19

Andyhigh 发表于 2014-4-6 15:17
% z% |8 ^$ U1 ^0 ^您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！, U* }- X; N# m, m1 f  I7 b0 @$ q; c
我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希 ...

# Q; @1 V: @  G* J. k, y. b实在汗呐，下了文章后匆匆瞄了一眼摘要，跟Andyhigh一样，一开始也以为是用四因子蛋白诱导鸡细胞重编程的。大家都在热火火的用转导肽介导四因子造ipsc，这篇文章的作者反其道而行之，由此想到利用转导肽融合的干性因子去阻止鸡ESC在传代过程中多能性丢失，这是做ESC培养基研发的节奏啊。Andyhigh兄已经对文章评价的非常到位了，不多说了。
) {/ W& h/ L& \. Q9 ^  H文中中超声破碎细胞的溶液应该是PBS吧（cells were washed twice with PBS and then ultrasonically disrupted），若有其它特殊的缓冲液应该会在方法中说明的。
( w& Z, }% [$ @, C4 Y+ W" v293FT的转染效率，文章中也没说，但我利用lip2000转染过293FT（文章用的磷酸钙沉淀），效率超高，90%以上了，24小时的GFP几乎就全亮了，48小时达顶峰。
6 x, j+ f9 Z8 ^1 f. h5 E0 J  f质粒线性化主要是为了稳定细胞系筛选时便于DNA片段插入基因组，瞬时表达时对转染效率和表达量并无助力，所以文章中估计没有线性化。" i/ e& [  W0 ~1 B+ _4 O* |
人和小鼠的ESC是有可长期传代的细胞系的，这个大家估计都知道，置于其它的俺是小白，就不清楚了。倒是可以查下大鼠，果蝇，猪和牛是否有ESC细胞系。

xray19

回复 Andyhigh 的帖子2 M6 E# M. [% z9 J& o/ t+ h
9 `3 q* t. [2 E& V% t  ?
楼主好厉害。我不是作者，把文章down下来一直在偷懒没有看，还搞错了文章内容，真的好惭愧。。。。
: P# j2 `4 u7 I& I0 S1 W0 e9 V7 r先不说话，赶紧看文章6 O" P# t7 l, `' |( _

" o0 L  B/ g2 o7 c! u

Andyhigh

xray19 发表于 2014-4-6 11:56 5 }' A0 a7 \1 F# [1 ]
不好意思，昨天没上传上去

3 D- ^$ j- L; _# D5 a/ E4 E1 v
您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！
$ ^! u* W! A8 u# E1 w我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希望能起到抛砖引玉的作用。7 M% ?, U$ e  z3 d$ m2 b- a' R

1 E: S7 n: P. [7 w4 k+ f1. 刚打开文献，查了下杂志的IF，并以为是一篇用4因子（OSNL）诱导鸡体细胞重编程的文章，但看过摘要后发现自己错了，这是一篇”利用重组蛋白探索鸡ESCs 培养体系“的文章，文章具有较好的创新性，给了我一些启发，如在 用蛋白介导体细胞重编程后，是否可以利用重组蛋白 一直维持干细胞的多能性，甚至创建一种新物种ESCs的培养体系，值得尝试。
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2. 文章的思路: A. 用EGFP验证9R的功能； B. 国建pCMV-PF-9R-IRES-EGFP载体，瞬时转染293FT细胞，提取蛋白并浓缩； C. 加到鸡ESCs培养体系中，观察传代次数（一系列的检测指标），发现重组蛋白能抑制鸡ESCs的分化，能在体外维持ESCs的多能性' ~- E7 m& v' V/ N5 ?, q4 j) J
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3. 有一些疑问:  目前哪些物种获得了可以再体外长期传代的ESCs，求高手指教！！！另外文章中超声破碎细胞时的溶液是什么，还有转染效率怎么样（出现绿色的时间和比例，质粒应该没有线性化吧）这点自己比较感兴趣，希望Xray19能告知) A$ ~( k% H+ I" b8 j  I) `8 [  v0 K

0 c9 }; T9 x* N+ K1 j( J4. 文章整体比较简单，不过也是一个完整的Story，自己推测应该是一名研究生做的工作。顶一个
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xray19

2 o$ t0 n/ J! \# O
不好意思，昨天没上传上去

Andyhigh

xray19 发表于 2014-4-5 23:06 , @0 I1 f  m; i; {$ J6 g- ^! y
感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

: Y& {; T3 ]* o$ b- P
最好上传下文章！！！

xray19

感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

xray19

wanglimaomao 发表于 2014-4-1 17:02
8 s; @! V* Z0 O4 K( \9 J我对蛋白重编程不是很了解。但是针对不能扩增传代有点想法。也不一定正确，欢迎批评指正。首先体外合成的蛋 ...

3 q! @1 f; N2 R7 C) `  L5 g即便将4个基因整合到基因组中，当细胞向ipsc转化过程中，外源表达的基因会逐渐被沉默的，直至最后完全沉默。与此同时，细胞内源性的干性基因会逐渐获得表达。