2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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# |" V  A/ i" S题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！
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一. 文章的结构：
9 i! h1 b7 ^% u4 j, E$ @1 O3 G1. 蛋白的制备分为A、B两组：% D2 J" U' A: I- I6 R
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。* D+ V: I# C' N% Q5 B! T
B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
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2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白) Z# k2 m& Q$ z. g
考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
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: H( S; }& n( M7 ?3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比7 O& x/ K. u; z* C- y# P$ c

1 z# z( F$ H4 ?5 T$ z二. 总结
, q, m- o& d7 o  Z! c& h8 U! s5 ]1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
! P+ {' a& R3 Q- c6 G( g, `2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的0 g8 y& @8 @% H* j" r* F* m# U
3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
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三. 疑问
/ j7 w' L3 |! X  @7 S, u1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点0 B9 T  T0 P& n6 ^
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
6 i. U9 ]& S; }/ q7 |3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？  h. u  }( U8 n7 J( Y* m, C; c2 r1 Z- ]
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   5 E; T) h# j, o& W5 K: P5 q

( I: q6 u8 {3 K( x3 P欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！' n; L9 B$ C3 l% j1 v

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9 T0 }0 c. E, h! G0 h/ e补充内容 (2014-3-29 22:10):0 X. V1 j7 z2 Q- E" a8 ?
关于蛋白质介导体细胞重编程:
% j6 C- s) w0 b" f$ y9 T1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；! J8 _' ^/ i9 y- F4 ~4 K
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！5 p' I. u( Z2 E) _; m

+ K& _4 D( u$ [8 ]补充内容 (2014-3-29 22:16):
+ r7 g2 G: L9 d) C4 F* N/ k3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？: t9 M* ?0 f# t9 D( [, z4 ~

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5 S7 d4 D: y1 n; _- F, y; x3 x: J$ Z补充内容 (2014-4-6 14:55):
9 v4 q* @0 m2 g9 ^6 a/ p0 O感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

xray19

回复 Andyhigh 的帖子5 a. k+ f0 g1 ?% G9 s

+ }& \* i$ G7 o! `权限不够，还加不了好友。有机会多就ips 聊聊

Andyhigh

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$ I- ^. k: k: M) `0 y  f/ x/ }
/ K2 ?7 a' s! V) N大鼠的ESCs及培养体系有，猪ESCs也有，但是缺乏培养体系，其他的不太确定，估计绝大部分都没有公认的培养体系。

xray19

Andyhigh 发表于 2014-4-6 15:17 : K, F3 @( c# w! ]& R
您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！
1 ^9 j  r5 M5 s" h1 h8 r我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希 ...

* L* ]1 u. O" f  H' |实在汗呐，下了文章后匆匆瞄了一眼摘要，跟Andyhigh一样，一开始也以为是用四因子蛋白诱导鸡细胞重编程的。大家都在热火火的用转导肽介导四因子造ipsc，这篇文章的作者反其道而行之，由此想到利用转导肽融合的干性因子去阻止鸡ESC在传代过程中多能性丢失，这是做ESC培养基研发的节奏啊。Andyhigh兄已经对文章评价的非常到位了，不多说了。/ U$ g2 W) T( F+ s2 f' l
文中中超声破碎细胞的溶液应该是PBS吧（cells were washed twice with PBS and then ultrasonically disrupted），若有其它特殊的缓冲液应该会在方法中说明的。1 a  g' U2 c( D7 n; y
293FT的转染效率，文章中也没说，但我利用lip2000转染过293FT（文章用的磷酸钙沉淀），效率超高，90%以上了，24小时的GFP几乎就全亮了，48小时达顶峰。8 ^  X" }0 `; t/ f9 I3 e
质粒线性化主要是为了稳定细胞系筛选时便于DNA片段插入基因组，瞬时表达时对转染效率和表达量并无助力，所以文章中估计没有线性化。
# B- I0 w' X2 x) n, }人和小鼠的ESC是有可长期传代的细胞系的，这个大家估计都知道，置于其它的俺是小白，就不清楚了。倒是可以查下大鼠，果蝇，猪和牛是否有ESC细胞系。

xray19

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6 ^) D8 k) I) C" x( N' S+ q( q1 }# c! x3 D( k7 m9 [6 L! r
楼主好厉害。我不是作者，把文章down下来一直在偷懒没有看，还搞错了文章内容，真的好惭愧。。。。2 Y5 o1 l2 y( o* ?1 O7 u" a
先不说话，赶紧看文章
8 ?& i2 u1 G6 h% K4 ^& I9 P; s: A; F$ o0 Z- _! z& v4 \8 ]# Y

Andyhigh

xray19 发表于 2014-4-6 11:56 & e6 u# K5 C& V2 H! o
不好意思，昨天没上传上去

. I$ O2 H& E' {: }4 \3 ]8 ]- F2 @; b
您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！
2 N4 d, b9 F% b我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希望能起到抛砖引玉的作用。
& h+ n* Z1 ~/ h' a5 M
* i% ?3 b* w  e7 Q2 L1. 刚打开文献，查了下杂志的IF，并以为是一篇用4因子（OSNL）诱导鸡体细胞重编程的文章，但看过摘要后发现自己错了，这是一篇”利用重组蛋白探索鸡ESCs 培养体系“的文章，文章具有较好的创新性，给了我一些启发，如在 用蛋白介导体细胞重编程后，是否可以利用重组蛋白 一直维持干细胞的多能性，甚至创建一种新物种ESCs的培养体系，值得尝试。6 X0 |* C- A9 w( y; P

2 j6 E. j4 \% Y2. 文章的思路: A. 用EGFP验证9R的功能； B. 国建pCMV-PF-9R-IRES-EGFP载体，瞬时转染293FT细胞，提取蛋白并浓缩； C. 加到鸡ESCs培养体系中，观察传代次数（一系列的检测指标），发现重组蛋白能抑制鸡ESCs的分化，能在体外维持ESCs的多能性! o3 S! @- |' Y5 K9 u: O

8 U, u) `4 R* I( Z  Y# z3. 有一些疑问:  目前哪些物种获得了可以再体外长期传代的ESCs，求高手指教！！！另外文章中超声破碎细胞时的溶液是什么，还有转染效率怎么样（出现绿色的时间和比例，质粒应该没有线性化吧）这点自己比较感兴趣，希望Xray19能告知
6 o5 `$ _5 n- }& }8 y3 I4 S% w# S5 t& z( C7 }# o' ^5 Y: f* v
4. 文章整体比较简单，不过也是一个完整的Story，自己推测应该是一名研究生做的工作。顶一个" g9 j3 @- R; Y% Y2 `3 ^

xray19

+ a  x& f1 V8 J5 j" `, A% r不好意思，昨天没上传上去

Andyhigh

xray19 发表于 2014-4-5 23:06
0 q3 U6 _, j9 {! z) S1 H感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

: V  y3 N- \( _最好上传下文章！！！

xray19

感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

xray19

wanglimaomao 发表于 2014-4-1 17:02
4 r/ x# V+ m+ V: X, `我对蛋白重编程不是很了解。但是针对不能扩增传代有点想法。也不一定正确，欢迎批评指正。首先体外合成的蛋 ...

0 v4 F  o# W: E6 E. ~
即便将4个基因整合到基因组中，当细胞向ipsc转化过程中，外源表达的基因会逐渐被沉默的，直至最后完全沉默。与此同时，细胞内源性的干性基因会逐渐获得表达。