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miRNA在翻译的早期阶段造成翻译沉默
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6 b9 o0 Z. E; D$ ~Gunter Meister
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) B( B% ?+ r! }; Q8 N# p w; CCell 131, 25 – 28, October 5, 2007, h' d$ O8 p+ p
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微RNA(miRNA)通过调节mRNA稳定性和翻译控制基因表达。若干实验室最近用无细胞体系对miRNA指导的翻译抑制的分子机制进行了深入研究，他们的新发现表明miRNA在翻译起始的早期阶段抑制翻译。
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微RNA(miRNA)由一类非编码小RNA组成，在基因沉默中起关键作用，是巨大的基因调节网络的一部分。尽管为miRNA编码的基因存在于各种生物（植物、动物和病毒）中，但大多数miRNA的细胞功能仍属未知。在经由RNA聚合酶II或III转录后，miRNA转录产物被加工成具有茎—环结构的miRNA前体，再进一步由RNase III Dicer加工成长度约为21核苷酸的双链miRNA/miRNA中间物。下游的解旋和加工活性选择一条链成为成熟miRNA，另一条miRNA*链则迅速降解。miRNA专一性地与Argonaute(Ago)蛋白家族成员相互作用，掺入到被称为miRNP的巨大核糖核蛋白效应子复合物中。
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& F5 A6 `0 ~, Q9 I3 E2 G' k 动物中的miRNA主要与位于靶标mRNA 3’ 非翻译区域(UTR)的部分互补结合位点杂交，抑制该mRNA的表达。有效的抑制作用可通过两种方式进行：（1）干扰翻译；（2）通过引导mRNA脱腺苷酸化和脱帽，启动mRNA降解。在植物中及极少数动物中，mRNA含有高度互补的miRNA结合位点，因此miRNA可以类似于RNA干扰(RNAi)的过程，指导mRNA的序列专一性切割。由于近年来的广泛努力，已对RNAi中的RNA序列专一性切割机制有了详细的了解。然而，miRNA指导的翻译抑制以及mRNA不稳定性的分子机制尚未得到充分理解。
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四个不同的研究小组在他们最近的工作中通过使用体外无细胞体系找到了miRNA功能的细节。这些发现是miRNA领域的重要转折点，因为这些体外无细胞测定可以对miRNA指导的基因沉默机制进行详细的生化解析。 ~5 o* P8 y8 I( |: B! m
5 I5 L$ h6 x& w! t* V* i" ~在翻译起始阶段的miRNA干扰
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# }$ r: }2 K3 h2 m7 Y+ ^* d K; z! p 尽管已报道过一系列miRNA靶标，但受miRNA调节的大多数mRNA仍属未知。因此，有关miRNA指导的翻译抑制机制的研究是采用有非最佳miRNA结合位点的人工荧光素酶的构建物。这类报告基因对细胞的转染表明，有效的miRNA翻译抑制需要有一个7-甲基-鸟嘌呤(m7G)帽。然而，有一项研究证实需要有poly(A)的存在，而另一篇文章报道miRNA指导的翻译抑制与poly(A)尾无关。 W$ | [ B9 h
- x/ F, s$ [2 j8 Q* c& S5 I/ r 为了用生物化学研究miRNA在翻译中的作用，Wang等使用兔网织细胞溶胞系统展示了miRNA指导的翻译抑制需要有功能的m7G帽和poly(A)尾。目前Wakiyama等建立了一个无细胞抽提物系统，是从超量表达已知RNAi组分（如Ago2和GW182）的人胚胎肾细胞HEK293得到的。人GW182也称为TNRC6A，属于含有3核苷酸重复序列的蛋白质家族。已有研究表明TNRC6A和TNRC6B是各种生物中miRNA指导的的基因沉默所必需的。Wakiyama等使用在3’ UTR含有6个人工miRNA let-7结合位点并有生物素化帽及聚腺苷酸的报告mRNA，证实有FLAG标记的Ago2以及FLAG标记的GW182都专一性地聚集到报告mRNA上。在这种无细胞系统中，有效的翻译抑制需要m7G帽和poly(A)尾。有趣的发现是，在HEK293细胞溶胞物中，在3’ UTR中含有let-7结合位点的mRNA完全脱腺苷化，该过程依赖于let-7。脱腺苷化与翻译无关，因为加入阻断翻译延长的环己胺对脱腺苷化无任何影响。值得注意的是，Wakiyama等同时使GW182表达，该蛋白可使脱腺苷化酶聚集到mRNA上。在这个系统中，miRNA功能可能偏向于脱腺苷酸化，在野生型HEK293溶胞物中是否可观察到类似的现象令人关注。3 S' D3 h* x3 J9 d' y
* B+ l3 e. j6 t' i# I+ s Sonenberg及其同事在最近的研究中使用了未修饰的哺乳动物细胞抽提物。Mathonnet等使用小鼠Krebs-2腹水细胞抽提物和携带6个人工let-7结合位点的荧光素酶构建物，证实报告基因的翻译依赖于反映内源let-7水平的let-7浓度。上述作者通过在细胞溶胞中孵育放射性标记的mRNA，证实至少在反应的最初40分钟内，let-7报告基因和对照报告基因的mRNA水平类似。因此，报告基因活性的不同是由于对翻译有不同的影响。有趣的是，在后期时间点，mRNA水平下降，这种效应取决于let-7。这表明在miRNA指导的基因沉默中，翻译抑制属于早期发生事件，随后有某种程度的mRNA降解。Sonenberg等又利用无细胞体系的优势，分析由let-7抑制的翻译步骤。他们用甘油梯度发现，在使用let-7报告基因时，80 S核糖体复核物的形成大大减少，这证实let-7抑制核糖体向mRNA的聚拢。此外，加入重组eIF-4F(mRNA帽结合复合物)，可干扰let-7指导的翻译抑制，这说明miRNA通过作用mRNA帽结构抑制翻译起始。8 s* s5 b0 f% u
! P$ ~2 z1 `- r1 O0 gArgonaute蛋白与mRNA的m7G帽相互作用
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9 l! a. r& I' } Mathonnet等和Wakiyama等通过体外测定得到的数据产生了这样的问题：与靶mRNA 3’ UTR结合的miRNP怎样干扰翻译起始？Mourelatos等通过详细分析人Ago蛋白的氨基酸序列，在Cell上报道了解答上述问题的主要进展。Ago蛋白有一个与eIF4E的m7G帽结合基元类似的高度保守基元。这个基元的特征是有两个带有芳香族侧链的氨基酸，其侧链可与m7G帽专一性结合。从HEK293细胞分离的标记的人Ago2可专一性与m7G-琼脂糖凝胶结合，而两个重要的苯丙氨酸被突变的Ago2变种则不能有这种结合。有趣的是，Ago2突变体仍有切割靶mRNA的能力，这说明上述突变没有改变Ago2的折叠。当Ago蛋白被人工结合到mRNA 3’ UTR时，可抑制翻译。然而，在m7G帽结合基元中有突变的Ago2变种不再抑制翻译，这说明Ago蛋白与mRNA帽结构的相互作用是翻译抑制所必需的。根据这些观察，我们提出一个miRNA指导的翻译起始干扰模型。在该模型中，Ago蛋白和eIF4E竞争与mRNA m7G帽的结合。一旦Ago蛋白与m7G帽结合，eIF4E不能再与该帽结合，由此造成翻译起始抑制。
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- Y4 |3 F( j4 JmiRNA可诱导形成假多聚核糖体$ T+ q6 e, C! P; {% q4 n
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Thermann和Hentze进一步提供了miRNA指导的翻译抑制的细节。他们将6个reaper mRNA的miR-2结合位点引入萤火虫荧光素酶报告基因中，并与果蝇胚胎溶胞物一起保温。与上述体外系统类似，内源miR-2抑制miR-2报告基因的翻译，这种抑制作用需要有完整的mRNA帽结构。和在小鼠细胞溶胞物中观察到的一样，在含有reaper miR-2结合位点的报告mRNA上的80 S复合物的形成受到抑制。Thermann和Hentze认识到，在受到miR-2抑制时，miR-2报告构建物向蔗糖梯度较重的部分移动。这种移动在有环己胺时可发生。环己胺可阻断翻译延长，使多聚核糖体形成。由于这些构建物在密度梯度中与多聚核糖体一起迁移，Thermann等将其称之为“假多聚核糖体”。进一步的研究揭示了在假多聚核糖体中有miR-2，这些结构形成很大的对EDTA敏感的mRNA—蛋白质（mRNP）复合体。假多聚核糖体是什么？它们在miRNA指导的基因沉默中起什么作用？假多聚核糖体很明显是很大的蛋白质—mRNA聚集物，因此很容易设想这种聚集物可能与细胞质加工体(P体)类似。P体有高度动态的结构，有不同的形状，与miRNA功能有关。EDTA敏感性说明假多聚核糖体可能是可逆结构（P体也是这种结构），这说明聚集成假多聚核糖体的被抑制mRNP也可能解离，恢复有效翻译。这可以解释最近有关作为miRNA靶标的mRNA位于P体以及miRNA指导的翻译抑制是可逆的等发现。值得注意的是，只在使用果蝇胚胎溶胞物的系统中观察到假多聚核糖体，在小鼠Krebs-2腹水细胞中没有同样的发现。因此尚不清楚miRNA指导的假多聚核糖体的形成是否是一个普遍现象。
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" F. w- Y A4 ?. a: P# Z6 E Thermann和Hentze的研究工作的一个令人惊讶的方面是，对于形成假多聚核糖体，不一定要有完整的m7G帽，因为在含有不支持翻译起始的人工无功能帽结构(A—cap, ApppN)的mRNA上，也能形成假多聚核糖体。然而，miR-2指导的荧光素酶报告基因mRNA上的80 S复合物组装的抑制，必须要有m7G帽。这些发现说明假多聚核糖体及P体的形成并不需要miRNA对翻译的有效抑制。miRNA与3’ UTR的结合和翻译起始的抑制可能对大多数多聚核糖体的形成是足够的，既使该抑制与miRNA途径无关。
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在miRNA指导的翻译抑制的研究中尚未解决的问题
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最近报道的无细胞翻译系统很明确地提出一个miRNA干扰翻译起始的模型。然而，早期在线虫中的研究以及最近在哺乳动物中的研究表明，miRNA与多聚核糖体共沉淀，这导致出现miRNA参与调节翻译延长的观点。在某些研究中，在加入可解离多聚核糖体的嘌呤霉素后，miRNA与多聚核糖体的共沉淀受到破坏。也有研究表明，当mRNA受miRNA调节时，新产生的多肽链迅速降解。此外，也观察到当miRNA与3’ UTR结合时，核糖体从mRNA上脱落，由此产生了有关miRNA功能的核糖体脱落模型。& w+ L$ d6 y+ J8 s& i& Q
2 s2 {& U& h8 F4 V0 d: Y7 ]* ^; V 怎样解释这些miRNA功能的差异？尽管miRNA在翻译起始中的作用已得到充分证明，但不能排除miRNA在翻译的其他阶段也起作用。有理由推测miRNA对不同的mRNA有不同的功能，或在不同的细胞发育阶段有不同的功能。应注意大多数有关miRNA功能的研究都是用含有人工或分离的miRNA结合位点的报告基因进行的。这类报告基因对推测miRNA功能的基本机制和步骤非常有用。然而，在较大的天然3’ UTR中，这些功能可能有所不同，因为这些结合位点在3’ UTR中的位置以及与其他调节蛋白的相互作用是很重要的。在某些研究中，miRNA途径中的miRNA或蛋白质组分与多聚核糖体的共同迁移可能被误认为是与多聚核糖体结合。在Thermann和Hentze最近的研究中，这种结构可能是很大的miRNP聚合物或假多聚核糖体。
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3 n/ n' w9 N0 B H9 R 尽管还没有最后的结论，但很明显miRNA至少有一个功能是抑制翻译起始。已报道的无细胞翻译系统的数据引发了许多新问题。假多聚核糖体是怎样形成的？这个形成过程是怎样调节的？这种结构怎样解离？怎样再进入有效翻译？假多聚核糖体的蛋白质组分是什么？与P体有什么关系？将这些新生化系统与蛋白质组学方法和其他细胞生物学研究相结合，可帮助进一步推测miRNA的功能。1 f3 e2 A f) Y6 B$ v3 a
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本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:29
发表于 2010-2-8 21:59
