求救，转染的问题

always_wp

要是向ES或者IPS内再转染一个目的基因，有没有谁做过啊 ，给些建议啊~多谢了

bllx58

你打算用什么方法，之前向ES R1做过转染病毒的，带报告基因的，几乎转不进去~~~效果很不理想

sdyinong

我们用的慢病毒转染MSCs，效果还不错，我看过几篇文献也是用慢病毒转染ES细胞，甚至有的还用lipofectamine2000转染，

wwy551

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6 {/ M) U3 U" {
! e) s0 |. L6 u# y5 d看你要往人还是鼠的ES/IPS里面转基因了，我做过很多次向人的ES里面转基因。Dispase消化HESC，吹打成很小的细胞团块（注意不要吹打成单细胞，人的ES或IPS单细胞形成克隆的能力不好，如果是鼠的ES或IPS应该就没问题），用0.5毫升HESM和0.5毫升浓缩后的毒液在15毫升离心管里悬浮感染细胞团块，记得加1000*Polybrane。37度孵育2~4个小时，然后转到MEF FEEDER上（事先准备好MEF FEEDER，把毒液感染的ES细胞团块转来之前，先用DF12洗干净MEF），加新鲜培养液至合适体积，过夜后第二天换液。

always_wp

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+ F3 c( @7 ^6 N$ b& V) Q# o
( [4 ~9 a) e: P; h2 {是不是说相当于悬浮转染了呢，就在试管里进行转染后4h的孵育

always_wp

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. U' e% s) V7 O; s
; @  d& Y* H/ A" ^你好，请问你那里有没有文献可以让我参考一下啊，就是关于慢病毒感染ES细胞% M' Y' z% c4 a

always_wp

回复 bllx58 的帖子- H( k/ W+ n9 A5 e) c/ }' q7 f# R- }+ @

* V4 f% n3 b4 A" ?我和没有确定方法，脂质体，电转，病毒感染都想试一试，不知道哪一种好些

wwy551

回复 always_wp 的帖子' K; ~, _/ c3 g8 s1 x, W
3 E% w# X# Y5 j& G$ A! p4 c/ ^
算是吧，如果是贴壁培养的细胞，离心转染（2500RPM，37℃，90MIN）效率会比较高，但是感染ES，尤其是人的ES，最好还是消化成很小的细胞团块，（否则ES克隆那么大，按常规感染贴壁细胞的方法，效率绝对很低）按我上面的方法来做，这个我们已经做过很多次，应该算得上是一种很成熟的在ES细胞系里面过表达外源基因的方法了。

sdyinong

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+ D  Q- ?9 ^5 J5 c( ~% d# O4 l. d; ^! [
这篇文章转染的是miRNA到ES细胞中

always_wp

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0 X( r9 F: ?  j: b5 Y: {" E# r3 v4 H: G# J
谢谢啦