脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下
# g: {5 J7 P3 s 我的实验步骤：
) I. l( V0 ]* }+ i. M  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
# F$ }  z5 Q/ f7 x/ t& C  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。
. `8 e7 f% t( b* P  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。
3 C8 j7 W' S- x5 N& i  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
. B: v: `  [# J1 T3 S! k. q/ i  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。; ^! K. U; l3 ^: f3 |
  6、弃上清，加入全培培养。; m  R5 H4 O; n2 I  V: z

, K' d" t1 e3 l' ?- U按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

amberma

几号胶原酶？如果4号 太温和了 30min 时间太短- A' w, w0 g3 ], O$ E# V7 z
试试胰酶10-15min9 Y! U: j0 V, r0 ~# j

loveless

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4 j7 k8 v" F$ Z6 Y- c9 Z' j4 N% B0 z  r" L: R" K* @9 \9 I
我用的是I 型胶原酶，30min。

willing

是没有细胞长，还是什么情况？

loveless

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6 D5 i& W! _8 c# I! W
8 h3 c- t. C: ~' C$ @有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

都市青蛙

每次你能取到多少脂肪组织？
& W. P( ^2 l; y* B有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

tangyihan

回复 loveless 的帖子# q& V( f0 j5 C# n

' }3 w& s0 u% T可以考虑:
/ I5 \* ^/ ~- k# s- h! M1.用0.2%胶原酶。
$ E) G6 J7 k8 \- I2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。
  h( S6 m; O  l- O6 f3.离心后用100um filter 过滤。
1 E6 t' r. f$ U7 r4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。
; j. S* D+ }% Y/ ]5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。
) [2 e9 \2 t% l7 F" J* r% `( J& `
- K0 Y- C6 @) ?  _9 H# w祝你成功！

loveless

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2 {! n# E% U7 C; |( i# }
, Z# T9 A* k/ _; A$ I, |我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

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+ ?$ C/ C8 x) g" J: o, _" F" O
8 q% }0 G- v5 [0 W" I! v% c9 ]# w( i# Q请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

tangyihan

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2 x9 a: H1 ]* }  d! y9 Q+ @9 d  W: ~4 _+ x% H! ?
用0.2%的胶原酶消化