Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：, f, B& h3 w7 t0 S6 s( n/ `
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
) [, g6 _7 D9 @) v2 a# r! u6 q       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
& C8 h! j" U, P- q) |  h$ s# r7 D; J! [( m; N% N5 l
2、反应参数的确定：
# ]  p% d. g9 S( n       一般为：94 ℃，10-20S
. i4 O9 f, g* \0 ?: o* E" W                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
$ y' e- U4 v/ C( b& m                     
7 p7 o& O* W- w3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
) H* l4 u0 D, k1 `( _% F  R       引物浓度：50-900nM
  Q/ D; {! s/ u3 [/ \5 A  {' f+ ?1 A       探针浓度：50-250nM% Y) R0 x  r5 E) k. z& L, k1 E

Tlexander

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