脐血干细胞复苏

刘艳85

我用FBS：DMSO为9:1的比例配冻存液，用于保存脐血干细胞，37℃水浴中溶化脐血干细胞，经离心洗涤，最后放入含1%白蛋白的生理盐水中，想问一下，为什么经过3-4h后会出现白色絮状沉淀？这个问题有什么比较好的解决方法吗？

刘艳85

我用的是2ml的冻存管，在37℃水浴锅中30s内溶化不了，我用的时间大约是1分钟到1分30秒吧，是不是这个时间有些太长啊？进而对细胞有影响？
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刘艳85

我们也是使用ficoll法制备的，数量在2*107左右，但是冻存复苏之后，细胞数明显下降了，细胞数为5.6X10的7次方，溶于含1%白蛋白的生理盐水中，放于40ml的离心管中。在显微镜下用台盼兰染色观察，细胞的活性是100%；即使是有白色絮状沉淀存在的条件下，细胞的活性也是100%，经测数发现，细胞的总数下降了，是不是死细胞啊？但是刚复苏时没有这种现象，是不是在一段时间之后细胞慢慢死亡啊？

刘艳85

谢谢！/ E$ A. b6 V. H) h- I
冻存管里所装的细胞约1.5ml，若是死细胞，是不是在生理盐水中慢慢的死亡，然后是释放的DNA缠绕死细胞，形成絮状沉淀，以至于即使有絮状沉淀，显微镜下看见的还都是活细胞。我试过放在含2%的白蛋白的生理盐水中，可是还是会出现絮状沉淀。是不是复苏或是冻存的过程中存下一些问题啊？纠结中   我观察这个现象的外界温度是20℃

刘艳85

用这种抗凝管应该没问题吧，平时取外周血也是这样做的吧。我分离的是MNC，没分离过MSC和EPC，可能它们的分离方法不同吧
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刘艳85

1、离心，2000rpm，10min，分离血浆和血细胞；/ q. R6 n4 n/ L% e6 F
2、去除血浆，血细胞与Ficoll分离液1:1混合，2000rpm，15min；
! c2 C. l! x) M8 c9 B2 o/ B3、收获其中的白膜层，就是MNC，用生理盐水洗涤后获得。7 i2 {, d7 B. }) E
希望对你有所帮助。

刘艳85

大约半小时吧，这个影响大吗？我们洗涤两遍，想问一下，是不是在4℃的离心机中离心效果会好一些啊？这时候的温度比较低，DMSO的毒性可能不会那么显著

刘艳85

想问问，依据您的经验这可能是什么方面的原因啊？复苏后的细胞，经洗涤两次又经移液枪的吹打，是不是会有很多细胞死亡啊？

刘艳85

谢谢，知道了