跑胶出现三条带？

gxbzjznn

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  q5 b2 {1 R3 |8 z9 h( ]$ p
" [* M, ?) N+ O$ ?# F' LTakara

gxbzjznn

回复 king8 的帖子6 ~% Y+ D& x0 o

; ~9 L$ ~3 o- }8 B1 ?7 w0 j1 D不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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5 {& V; F4 K: d$ A+ v8 `. P" ^6 P7 T8 l3 j* K
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

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/ ~% \' T$ p  T& H/ \# G+ W% R6 h- k( {* I3 |. D2 f
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

云飘过的思念

# l7 z, f- j8 N
% o# p5 h$ W: E) p0 ~回复 gxbzjznn 的帖子0 L4 D' }$ F* i

/ C/ z- M+ _: p恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

云飘过的思念

* K% o, C, [: {7 L# `2 g9 C

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
0 B" p" J: p# l2 u5 ]+ U1 f1 r回复 nichifanlema2 的帖子+ o# _2 \% D! _2 M0 l

, H; O* u$ I4 x4 b8 S- R我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

+ L0 G  N& y- x5 p! U6 a  ~
3 E5 m/ h- ~/ i) M8 i% M
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
' Z" s2 `2 W  a6 U. J8 |$ k1 E" d实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
( X) ]6 y' D/ r% b7 b0 |$ ?实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W/ Z0 J* j" x; c" [6 U  y8 B
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
  c6 o6 G; M$ o$ J  ~' \
: d" `) m; J; G! }9 G/ o$ m定量设备为NanoDorp2000

nichifanlema2

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" T" E5 V5 W( `4 z; W# n
% }3 N5 h* p& k' z/ p引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。