胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
3 f% C% s+ `3 W; Y/ a- o" _4 `$ g/ e( d  e! C
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
" U) D; {8 z8 Y2 \( q& m
4 Q! i' w+ u& U" Z5 K5 t7 |( k0 `% D 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
7 _/ x4 A& L6 M' E6 |+ ], f0 d3 l- N% o
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。$ R- L1 f1 [. {1 u4 W

8 ]: H2 ~4 `) j0 m, Z. x" `# _ 3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
4 y: x$ t6 y  T
2 t1 a& s! o5 L) l 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。1 c; I& O! I3 K1 G2 @. O3 L; U6 R
7 t4 h6 ^4 j) S
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。# I* W% M  V+ I- z/ g

( w6 @  {, ^  d3 ]& l' Z; r, O 二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
  R) F0 P+ _6 `! O
. p* [- }5 o& c2 q' G4 V0 z$ @ ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。5 l" X5 K9 k9 s7 \

/ ^1 Z; v! T: u+ G 培养基4 }4 z& N4 w+ h5 ?5 u: P
: S7 _% I& o+ {+ b3 j" Y% h
ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。  ~. c& ~# t$ l
/ j" T- Q! D3 w
贮存液
# P( R' R) f; e* O9 [; X# Z8 l: b+ T1 a2 K! P
DMEM(高糖)
* g4 G" S" s$ }3 t  s8 L
) e5 j! B2 _( v& }6 R; J 马血清（HS）
5 T0 \* P$ H# `1 T! f  J6 s$ ~. p! M. y  k( p
L-谷氨酰胺（200M）! E! D' h- ^9 h( g6 ~
" B- Q, u5 ?( @" O+ F( g+ a
MEMNEAA（10M）6 p( Q+ j8 g3 K& u% G1 d$ r

, C' l/ `, H1 l$ D HEPES（1M）& S' u; H% R+ R0 @- \9 o8 q

; m2 r: F+ p: s' | ?-巯基乙醇（55M）
6 V+ i! a1 h0 a! f* m" w$ g  v& ~; \( B
PEST
! @, O4 \8 f; F4 Z5 ]( @7 i5 n9 i3 e3 z" P4 q, B; |
ESGRO. D3 B, r( a9 \' o

* B% l4 n# L% b4 x0 V3 r4 O 复苏细胞
% N" R3 u/ Y4 p  m3 H0 `+ m9 n5 }3 K
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
3 G( P& k) o  s( V% W- R+ V  F# u6 h- j& q2 x5 R
步骤
2 t( e/ L- E* o, v5 P/ b9 Y
4 T% x$ r; o; x2 e5 j 1．从液氮中取出一管细胞；
3 y" |6 \. ^. w& u$ K0 ^4 E7 W' H, ^
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；( |- R2 m1 C, [" R
7 b! W# b- e) b) ~, [
3．将细胞转移到一15Fn管中；
* Z9 m- k- X/ c% y, X! C" I" q; |% e3 @% G7 J0 w
4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
2 D1 h7 z) A) `+ N3 P, h+ V7 P* y/ Y/ i6 ^! T& k& d
5．离心3分钟；6 Y8 ?$ I4 Z6 H5 ?

( T2 L1 a+ E. r& v 6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
9 W, u$ x4 [. l" z; R2 T' U! G5 @( h. ~4 s
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；: w/ f4 A, F1 K3 ?$ ~/ l: v
2 u5 I" g+ m! k" |1 f+ {4 m1 i/ G# l
8．孵育。