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- 威望
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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态* o# |3 h) K( b7 [! B% ?
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。+ \) ^( [. ~) o) E& c
0 C, i7 }- [9 ]" b9 ~. F$ o/ T
! J; g# W3 `( a0 N培养基4 h7 f7 ?/ r9 f% ~; h: g
ES:
" j) w4 L# X' N配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。( r8 B. ~8 \1 u! u7 v5 g q" ?
$ W9 W* D9 s$ J5 F& o# A" W贮存液 2 t! n% }0 e* m1 k( z: w1 D
DMEM（高糖） 6 t C) K) o' F/ s1 X5 x
马血清（HS）
j6 l, g r2 g/ s1 V5 c' c8 ]L-谷氨酰胺（200mM） , }7 m$ }8 x W0 z3 T$ y. w
MEM NEAA（10mM）
; t0 V- A- M' zHEPES（1M） # T6 _8 p; I2 u& w8 X" N
β-巯基乙醇（55Mm） . W5 [8 }$ e$ {4 m# o
PEST
0 n) h' u) v& h4 w9 [6 _ESGRO
4 y$ e) t/ ]# q/ o! Q0 H6 ~7 {7 O! r- L( @) L: [4 q! q; n5 C& M I
复苏细胞
, B* _: v, S. i/ s, u L细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
# `5 N7 [5 ^( Q
9 S! [6 |9 K# a6 Y" {0 x: {4 [步骤：- R$ I. f4 K9 d8 P, B& }
1．从液氮中取出一管细胞；/ r- V3 U' L* Q0 P8 U, z
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； a3 t8 G+ S4 ~+ j! K5 I' Q! _$ i; A
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
0 ~# K2 U8 H( S& L4 _4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
* O8 T3 o( k$ r+ m; W: ^) _5．离心3分钟；
- T J, `0 q; b8 a) I6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
8 a, q, I- y" u0 T0 v/ n7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
, i! ^3 T; R: e0 W8 q8．孵育。$ M6 k7 d5 {3 M5 \6 X5 l5 F
" _- D b) A, a. F) F- a( C冻存细胞
5 U# H) x; V+ v$ e7 a, I冻存液+ \0 J3 y$ p+ o. A4 n
90％HS和10％二甲基亚砜
1 O8 e* W$ Q0 Z5 ]' t$ p; [( {( Z7 F" n0 s" Q9 I
步骤：
0 L6 `' ]1 n% w- T1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；6 V* s) @% R" J; n3 y f
2．用细胞刮刀收集细胞；) `7 t- T* O Y: b+ }; G
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；$ r1 v( W T' g
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）( _% H, }3 e/ T
5．分装于冻存管内，每管1ml；
7 [- D3 S+ |3 A+ W$ P+ {6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
1 J8 m8 J7 m, r! e& k. F
: F' G& E9 _' B% q明胶包被
- F' `( @8 n% D. H2 z: F准备500ml 0.1％明胶溶液
% `7 q8 ]' j4 F% I- B8 t1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
. j+ T9 l$ {- i" j2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
* T4 [7 e$ x# F) v2 J( J: x6 v包被培养板或培养皿
* c: t C, d5 V' I6 m1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；- |3 l) |/ x u& p
2．置室温30分钟；
" S8 k9 y, F. }7 d2 T' Y3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
