求鉴定养的是不是脂肪干细胞，及解答培养中的问题，急求帮助

苏合香榭

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. y% V" f& k: J0 S3 F求解答这是不是脂肪干细胞，为什么我养的细胞量那么的少，还有就是脂肪组织用PBS洗的时候会沾上PBS，这样会不会影响胶原酶消化效果呢？为什么消化完，离心后，上层会有一层脂肪组织呢，这是没有消化完全么？离心后分为三层，最上面一层应该是什么形态的呢？

zfn0843086007

脂肪细胞在消化完成后，细胞量比较少，消化完全一般每单位能够收获500个单位的细胞。在用缓冲液洗涤后，用胶原酶消化不会影响消化效果。消化完成后细胞是分成三层的，最上面一层为脂肪，中间一层为消化液，最下面一层为混合细胞层。最上面一，你可以看到他们带有金黄色的小油珠

zfn0843086007

你培养的细胞很杂，需要继续纯化培养

苏合香榭

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是呀，但即使这样细胞量还是很少，我没有过滤，也没有用裂解红细胞这样行不？养好久依旧是这么些东西，感觉细胞一点也没有增殖？用哪种培养基比较好呢？

苏合香榭

回复 zfn0843086007 的帖子6 W. ~0 M6 \4 ]. _. i+ P- w! X

( f4 c0 f5 b* D( Y' Z还有胶原酶我用的是PBS配的，用培养基配会不会更好点？每次称胶原酶的时候感觉胶原酶有的冻成块了，感觉不是特别干燥，是不是胶原酶的事，正常的胶原酶是完全的粉末么？

zfn0843086007

如果你消化得到的细胞数量少的话，建议你采用漩涡震荡仪震荡60秒，这样得到的细胞数量会多很多；还有一种方法就是采用胶原酶和胰酶共同消化；消化后收集到的细胞培养24小时后要换液，将不贴壁细胞洗涤掉，再进行细胞培养换液，一般经过三次细胞的培养和换液后细胞纯化的差不多了，我培养换液三次后经过流式细胞的检测标志物，其93%的细胞为间充质干细胞。

zfn0843086007

胶原酶的配制采用PBS和培养基对其作用没有什么影响，不过一般为了方便简便操作，我们一般采用培养基配制。我们在配制胶原酶的时候没发现胶原酶成块的情况，但是有时偶尔会发现有成团的，但是不是很严重。

苏合香榭

回复 zfn0843086007 的帖子, r$ G: D1 w$ |8 U6 S4 _

( D8 A5 `8 W4 Q: ~谢谢前辈啦，还有问题想请教您，就是涡旋震荡仪是在消化之后使用吗？我们中和消化后会吹打，这样会不会和涡旋有同样的效果？还有就是最后重悬沉淀的时候会发现有好多成块的吹打不开，你们有没有这种情况，最后重悬细胞时一般要吹打多长时间呢？

沙漠狐o0

呃...细胞挺杂的，脂肪干细胞比例过少。5 o  \: e9 S1 _+ h5 b; h
消化可以使用0.2%胶原酶Ⅰ+0.3%BSA。
3 T2 o& l) M1 f. t3 ?' ^24-48小时细胞贴壁之后换液。
+ O  c5 Q1 ]6 B9 j6 V: V也可以使用贴壁法进行培养。操作方便。
- E! O  O' p1 C8 a; p, L培养基可以使用DMEM，但是建议使用大公司的无血清间充质干细胞培养基。

smile微微笑笑

脂肪干细胞，我更倾向组织贴壁法，将组织处理干净后，剪成小块，贴在六孔板板底，然后将六孔板倒扣放置培养箱中，约2h左右，再添加少量培养基，不要将组织冲起，放到培养箱后，注意观察不要让培养液干了，3-4d后，细胞就可以爬出来了，等细胞长到一定量时，可以将组织转移到新的孔板，继续培养，这样可以收获很多原代细胞！但贴壁法时间比较久，消化可能收获细胞更快，但数量也相对少些！