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标题: 求助：自体血浆的处理 [打印本页]

作者: gengtongyu521 时间: 2016-3-17 16:37 标题: 求助：自体血浆的处理

用枸橼酸钠抗凝剂采血袋采血后，处理血浆，56度灭活30min，但后期培养中，添加自体血浆，CIK细胞悬液中经常会出现絮状物，细胞活性受很大影响。我有时会重悬细胞后，过滤一下细胞悬液，去掉絮状物，再重新培养，但是细胞增殖不好，请问大家有没有遇到过？如何解决？谢啦，谢啦！

作者: chimo100 时间: 2016-3-17 16:57

血浆灭活后离心，去掉沉淀。细胞培养的时候，注意打散细胞团，不要等细胞团很大了再打散

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-17 17:01

灭活后4000转离心，取上清保存，添加自体血浆是必须的，对细胞长势有很大影响，出现絮状物即使挑出不需过滤。

作者: 吕小松 时间: 2016-3-17 17:04

56℃灭活30分钟，每十分钟上下颠倒一下，冷却后高速离心，丢弃掉沉淀，楼主是没有离心吧，怪不得有絮状的！

作者: 小猫狸狸 时间: 2016-3-17 17:05

回复 gengtongyu521 的帖子9 r7 Y8 Z$ ?* J s! z

你能否确定是添加血浆出现絮状物，还是细胞本身原因？7 i5 Y+ k3 y% |6 u5 z, z
若是血浆原因，可以考虑灭活后放到-20℃冰箱一会，待脂肪析出后3000RPM，10min离心，取上清液。但是就算偶尔出现絮状物，也对细胞增殖影响不会很大，要经常揉袋，一天两次吧。
还有一种可能也会出现絮状物，细胞分离后含有较多血小板或红细胞，在后期随着血小板或红细胞的死亡都会出现絮状物，只要后期处理得当，对细胞增殖影响不大。

作者: seergene 时间: 2016-3-17 19:18

回复 gengtongyu521 的帖子2 G3 D( i* n1 b* I9 Z$ n

以经验告诉你，出现絮状物有可能是血脂太高导致的，一般情况下无解，细胞很难培养出来，增殖出来的细胞也是以絮状存在，根本没法回输。我最近也遇到一例类似的情况，看看絮状物跟你的是不是一样。
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... d=115517&extra=

作者: seergene 时间: 2016-3-17 19:21

回复 gengtongyu521 的帖子

另外忘了问了，你用的是不是宝日医的培养基。其他的培养基我不太清楚，但是用他家的培养基最好不要用枸橼酸做抗凝剂，换肝素钠吧。

作者: cloudycity 时间: 2016-3-18 00:00

血浆离心的时候，最好把离心减速的加速度调低···不然还是会荡起来的···或者静置过夜····再取上清

作者: gengtongyu521 时间: 2016-3-18 05:12

谢谢各位的建议啦，我处理血浆是经过灭活后，离心的，3000rpm，10min。

作者: gengtongyu521 时间: 2016-3-18 05:12

回复 seergene 的帖子7 o% f2 u# Y* j, P

我用的是AIM-V培养基

作者: gengtongyu521 时间: 2016-3-18 05:16

回复 seergene 的帖子

谢啦我用的是AIM-V培养基。

作者: 拉二胡的拉尔夫 时间: 2016-3-18 08:37

这里分享一下我的实验经验：/ R/ l: ?9 W5 B1 e$ t" _% i
1.絮状物有可能是未去除的纤维蛋白原造成的，可以通过增加一点点Ca离子拮抗去除，或者通过反复冻融离心去除。! ?, R( I! Y4 I' \, d3 ]$ z( K' O3 s" x
2.枸橼酸处理的血清刺激增殖的能力比肝素查很多，所以肝素首选，枸橼酸次之，EDTA在次之。5 `' N7 T6 A4 C1 e- w2 A: Q ~6 ?
3.AIMV培养基是医用临床级别的，但是他前期刺激细胞增殖的能力很一般，所以更需要高品质的血清辅助。
希望能帮到你

。

作者: seergene 时间: 2016-3-18 10:12

回复 gengtongyu521 的帖子0 @9 R6 B5 F6 z+ {

AIM-V也用过，跟T551一样也会出现絮状物或培养基变成凝胶的时候。有人说是培养基或血浆中纤维蛋白原导致。我试过不加自体血浆培养过，同样会出现这样的问题。至于培养基中有没有纤维蛋白原，就不太了解了。还有人说是死细胞导致，个人认为可能性不大。这是版主推荐的以前讨论的帖子。3 R: n& \: k7 X" M, y
http://www.stemcell8.cn/thread-69130-1-1.html:

作者: mengnancy 时间: 2016-3-18 10:31

56℃灭活后4000转离心，取上清，添加自体血清的浓度过高了吗，一般0.5%-1%；另外细胞接种的浓度是否过大，红细胞是否较多，细胞增殖太快，营养不足引起细胞凋亡等，排除找下原因。

作者: why77yhw 时间: 2016-3-18 14:07

1.血浆不是必须添加的，只是提供营养成分，但如果培养基中的营养成分能够满足生长需要，可以不添加。0 J- c; O, F6 ^' `. H3 b
2.如果发现添加血浆后，细胞生长效果不好，应停止血浆的使用。
3.血浆灭火后需要离心去除补体，一遍不行就再离一遍试试看，应该还会有补体被离心出来。
4.供你参考：1.如果细胞体积不大，收集细胞，重新接种。& m4 k8 \4 \6 p9 k; `! _
                  2.接种前，吹打细胞，尽量吹散，吹不散也不强求哦~  X2 E- Q- w5 |' C' f  O
                  3.对细胞进行活率检测
                  4.调整到合适密度重新接种！+ U) F- v& \! J% V- ~' t0 m5 }
                  5.如果细胞活力低，检测下内毒素和支原体，排除掉其他因素。

作者: why77yhw 时间: 2016-3-18 14:08

另外还要补充，添加点人血白蛋白进去，能一定程度缓解，但因人而异，很具有特异性！试试看吧

作者: 免疫与细胞 时间: 2016-3-18 18:32

血浆每次使用之前最好离心一下( A: U2 y# K5 u9 n7 j5 ^4 x Q
6 u# g. m1 M: V8 ]/ G$ z9 J4 `
因为在低温下即血浆存放于冰箱的过程中，血浆内会析出一些物质，导致絮状物出现。

作者: 994545 时间: 2016-3-20 19:54

血浆用在前几天就够培养增殖了后面血浆在4℃保存的质量不能保证。如果是前期的絮状物的话：漂浮的可能是血液里的脂类，还有就是粒细胞分泌出来的物质及培养适应期死亡的细胞（这个可以在显微镜里看出来，对比前几天的细胞团状态）后期的话只能往污染这方面想了（表示没遇到过）。

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