滋养层细胞问题

wzm123hzy

尊敬的老师，师兄师姐们：% a8 t0 Z; C3 V+ G7 b7 j, B3 x/ u6 Y
      我想问一下在铺滋养层细胞后，细胞死亡率特别高，是由于培养基中加入双抗的原因吗？一般滋养层培养液需要加入双抗吗？谢谢

nichifanlema2

回复 wzm123hzy 的帖子
( b& o' W/ |9 G4 Z, h/ w7 M7 M1 l- d: `  E- O
我觉得应该不是双抗的原因，有可能是冻存的细胞和复苏过程出现的问题。冻存时一般用含有20%的DMSO，10%-20% FBS的冻存液，用冻存盒进行程序冻存效果比较好；复苏时37度快速融化。

Tim

回复 wzm123hzy 的帖子" n7 c: C# |2 `* T3 v
- l& |& n' H6 R- j" e( o
问题没交代清楚，你怎么制备饲养层细胞的？问题的关键点，

biovictor

回复 wzm123hzy 的帖子
+ F7 \2 L* a, |. B
1 I: s0 W! C9 S8 b楼主：! `1 V3 ]- @  d% l) F5 m- W
     滋养层细胞的制备关键是丝裂霉素的处理，1，如果楼主是铺板后，待细胞长满后处理，这种方法比较稳妥，方便制备大量的未处理的MEF来冻存，解冻后稍微养几天就可以达到需求密度，缺点是周期较长；2，如果是先在大皿中添加MC，然后再冻存保种，然后解冻复苏，这种方式可以快速铺板，但是缺点是会发生楼主的所述的显现，会死很多，如果冻细胞过程有问题的话，密度不好确定！

fananran2003

回复 biovictor 的帖子
; K( ]5 ?6 i9 u& Z5 P$ X) T9 c4 q: e( C/ Z' O
同意楼上的意见，可能是添加丝裂霉素后冻存再复苏可能会出现上述情况，丝裂霉素的处理会照成细胞死亡，复苏后又会死亡一部分！

wzm123hzy

问题已解决，主要是因为细胞刚复苏，状态不好，加之铺板时没有铺好，感谢老师、师兄，师姐们的热情帮助。