基因治疗技术之 T细胞疗法（CAR-T-肿瘤克星 )

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T 细胞也是在体外基因治疗中首选的热门改造细胞。T 细胞免疫疗法主要用于激活后天免疫反应，可以治疗肿瘤或HIV 病毒感染等慢性感染性疾病。从患者的外周血中就能很容易地获得自体T 细胞，并且在体外就能够进行培养和扩增。培养扩增以后用能够表达外源T 细胞抗原受体（T-cellantigen receptor, TCR）的γ逆转录病毒或慢病毒等载体转染进T 细胞，完成基因改造，最后将改造好的T 细胞再回输给患者，这些TCR就能够特异性识别肿瘤抗原或抗病毒分子了

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选择T 细胞作为改造目标是因为在用自体淋巴细胞回输技术对晚期黑色素瘤患者进行治疗时观察到了意义重大的、特定的肿瘤反应，这种肿瘤反应有时甚至会让肿瘤彻底消退。这种治疗作用可能与细胞在体外被激活和扩增有关，因为体内原本也存在少量肿瘤细胞特异性的细胞毒性T细胞，只不过被体内的微环境抑制住了。这些现象表明，后天免疫反应在肿瘤治疗中的应用潜力还是相当大的，只需要使其脱离抑制信号，并且回输大量的反应性T 细胞就能够达到一个比较好的效应靶标比（effector–target ratio）。先用去淋巴细胞药物（lymphoid-depleting regimen）对患者进行预处理，然后再回输经改造的T 细胞，这样也有助于提高T 细胞的植入效率及活性。

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AR-T cell therapy，

A game changer in cancertreatment

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前 言

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传统的肿瘤治疗方式：化疗、放疗及其近年如火如荼发展的单克隆抗体、小分子抑制剂等在肿瘤患者治疗中的巨大差异及较高的复发率，正面临着严峻的挑战。

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二十年前，Gross及其同事首次证明基因修饰的T细胞在对抗肿瘤细胞中的效果，从而奠定了CAR-T细胞治疗的基础。

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第一代CAR-T以融合scFV和CD3ζ 来修饰T细胞，尽管在体外动物模型研究中取得了鼓舞人心的效果，但靶向FR的CAR-T治疗卵巢癌患者效果欠佳，14例患者均没有观察到肿瘤负荷的下降，在共刺激信号缺乏的时候，第一代CAR-T容易导致T细胞无能和激活诱导的细胞死亡(AICD)；

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此后一系列研究开始开发整合共刺激信号的第二代CAR-T技术，显示出巨大的治疗潜力，尤其是针对B细胞表面的CD19分子的CAR-T治疗，对于难治性B细胞淋巴瘤的效果尤为明显。

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在近几年，针对新型分子和免疫学研究的进展为T细胞治疗提供了良好的基础，通过良好的CAR-T的设计、T细胞生产的优化及针对患者采用良好的预处理方法，这些进展都在为新的肿瘤联合治疗开辟新的路径。

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图1：TCR与CAR元件的识别与激活

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TCR由二硫键链接的αβ亚基的异二聚体与恒定的CD3链组成的复合体，TCR识别通过MHC分子呈递的细胞内和细胞外蛋白。 CD28分子通过其配体CD80/CD86，在IL-2和其他细胞因子的参与下激活，传递第二信号.绝大多数血液性肿瘤表达共刺激分子，但在肿瘤微环境中，实体瘤通常缺乏此类分子。

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CARs属于一类单克隆抗体上的scFv段与一个或多个T细胞受体内单个信号域(TM)结合的融合蛋白，CARs通过MHC非限制性的方式识别表面抗原，第一代CARs 信号主要通过CD3 ζ传导，第二代CARs包含有共刺激分子如：CD28，4-1BB，OX4，CD27，ICOS。

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T细胞治疗现状

T细胞过继治疗首次用于人体肿瘤的是应用捐献者的淋巴细胞(DLI)回输，用于一名骨髓移植后复发的髓性血液肿瘤患者，进一步的研究证明扩增的肿瘤浸润细胞(TIL)能够使大的血管转移性的黑色素瘤得到完全的、持续的缓解，对血液中循环肿瘤细胞(CTC)的监测也表明ACT治疗取得临床效果。然而此类治疗主要依赖于内源性的T细胞组份。

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近来的技术发展表现在：采用逆转录病毒或质粒载体来修饰的基因工程T细胞技术，通过大量的靶向T细胞(CART或TCRT)的产生来攻击肿瘤细胞，主要比较如下图。

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截止到2015年底，全球共有近8000名患者入组clinicaltrials注册的200多个临床试验，约85%的临床试验在美国和中国开展，大约65%的研究为靶向血液型肿瘤，CD19仍然是通用的血液型B细胞肿瘤的靶点抗原。目前在研的其他靶点抗原主要包括：CD20、CD22、CD30、ROR1、k轻链、CD123、CD33、CD133、CD138等。

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图2：如图显示为截止2015年12月在http://clinicaltrial.gov/上的ACT治疗试验(关键词为：T细胞、肿瘤)，200多例临床试验注册，约40%为CAR-T细胞试验，65%的研究集中在血液肿瘤。从PBMS中分离未经修饰/微小处理的T细胞治疗：TILs，15%；DLI,10%；病毒或抗原特异性T细胞，10%。

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影响CAR-T细胞治疗的疗效的因素

临床数据表明在T细胞的扩增与持续存在，是CAR-T治疗中获得肿瘤有效清除的关键因素，除此之外：CAR-T的设计、回输中T细胞组成比例、肿瘤类型、肿瘤微环境和患者的预处理情况都影响着后续的治疗效果。

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Savoldo及其同事采用第一代和第二代CAR-T细胞的混合组份治疗6名淋巴瘤患者证明了引入共刺激分子信号的重要性，临床试验表明包含CD28分子的CAR-T经历快速的扩增，但随之下降，而4-1BB分子信号能够使CAR-T持续存在。

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在淋巴瘤的鼠动物模型中研究发现，CAR-T细胞中初始T细胞的组份不同，呈现出来的治疗效果不同，病毒转导的记忆性T细胞呈现更好的扩增潜力，

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对于实体瘤的治疗，挑战依然巨大，它们所处的微环境不利于T细胞的生长，从而导致T细胞在此环境中无能。

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图3：图示为CAR-T细胞治疗涉及到的制造与运送环节。(a)首先从捐献者或者患者收集外周血(PBMCs)，(b)运送到GMP实验室，在偶联CD3和CD28抗体磁珠的介入下分离并激活；(c)表达CAR的病毒转导修饰T细胞，(d) 激活的T细胞在体外经过10-14天培养扩增达到治疗级别的细胞数，(e)移除磁珠，(f)包装或冷藏用于回输，在CAR-T细胞回输之前对患者进行有条件的化疗预处理。

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影响CAR-T治疗的安全性因素

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鉴于CAR-T治疗的巨大潜力，此种治疗的应用同样也会有很大的毒副作用。

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主要体现在：威胁生命的细胞因子释放综合征(CRS)和巨噬细胞激活综合征(MAS)、靶向/脱靶毒性、神经系统毒性、肿瘤溶解综合征。

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CRS和神经系统毒性在B细胞血液病治疗中常见，大多数病例可以治疗和逆转。应用单克隆抗体tocilizumab可以阻断IL-6的激活、减轻炎症反应，从而缓解CRS和MAS。

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靶向/脱靶毒性首次在应用 CAIX的CAR-T治疗肾细胞癌的患者中首次报道，数例患者经历的严重的肝毒性反应最后停止治疗。第1例致死的副反应发生在应用靶向ERBB2/HER2的CAR-T细胞治疗结肠癌患者，此例患者发生了严重的呼吸窘迫综合症，在治疗5天后，死于多器官功能衰竭。

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前 景

1.过继性基因修饰T细胞治疗肿瘤是一个革命性的方法，前景无限，目前有效性在如下血液肿瘤中治疗中得到证明：ALL,CLL,DLBCL,FL及多种黑色素瘤。

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2.针对实体性肿瘤的治疗，I期临床数据呈现良好的数据：主要包括过表达mesothelin，HER2，EGFR等神经母细胞瘤。

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3.挑战依然存在：提高CAR-T细胞在非血液性肿瘤中的特异性、有效性和安全性，同时采用联合免疫调节剂来治疗会对肿瘤治疗开辟一条新的途径。

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4.CAR-T细胞治疗技术的商业化道路必须考虑，且费用患者可以承担。工业化生产的T细胞依赖于自动化技术的实现。当前采用的集中的T细胞制造中心是否可以考虑去中心化，最好是在治疗中心进行CAR-T细胞的生产。

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5.基因修饰技术，T细胞筛选，扩增技术，安全和有效的病毒和非病毒载体的发展将进一步促进T细胞基因治疗的整合，最后，克服现有枷锁，在自动化环境下，开发通用的，可上市的，异体T细胞治疗药物将大大提高细胞生产的效率。

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将外源性TCR转移至T 细胞就能够免掉在患者自身T 细胞中寻找已经存在的肿瘤特异性T细胞的步骤，还可以好好利用人工合成技术，合成出高亲和力的TCR，而在体内必须经由胸腺的选择作用才能最终筛选出合格的TCR，决定自体细胞的免疫特异性。理想状态下，这种TCR会锁定自体蛋白中的肿瘤相关抗原，比如癌胚抗原或睾丸抗原等，正常组织此时不会表达，或者即便表达也检测不到自体蛋白。此外，它们还可以瞄准通常只见于某种特定肿瘤的致癌突变（“司机”突变），这些突变即便能够躲过免疫攻击，也是不会丧失的。不过最近的研究发现，大部分天然免疫反应或后天的、肿瘤特异性免疫反应针对的都是继发的“乘客”突变抗原，这种突变是肿瘤细胞内的随机突变不断积累而来的。因此，这种免疫疗法必须是高度个性化的治疗策略，既需要根据肿瘤的外显子组或蛋白质组信息来确定可能的“乘客”突变抗原，同时还需要利用专门的T细胞遗传工程学改造技术获得同源TCR识别序列。

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有关T 细胞免疫疗法治疗肿瘤的早期临床试验发现，虽然使用了针对肿瘤相关抗原的TCR，但也只针对部分肿瘤有反应，甚至在某些时候还会出现脱靶的现象，甚至导致组织损伤等严重的副作用。最近，研究人员又开始利用基因转移技术给T 细胞导入人工合成的嵌合抗原受体（chimaeric antigen receptors, CAR）。CAR能够同时兼具肿瘤相关表面分子结合抗体的作用，以及一个或多个TCR和共刺激受体复合体（costimulatoryreceptor complexes）胞内信号结构域的作用。这种CAR策略与传统的TCR策略相比有诸多优势。比如，在抗原识别方面不再限于HLA抗原，之前已经被证明是安全、而且特异性很高的体内识别抗体也可以通过单链抗体衍生物（single chain antibody derivatives）的形式被加入到CAR当中。而且，这些经过改造的T细胞在遭遇靶标之后都能够被充分激活。在使用了特异性针对B 细胞表面分子CD19的CAR外源基因的临床试验中发现，B 细胞肿瘤患者获得了明显的临床获益，甚至有患者的病情达到完全临床缓解，而且耐受良好，毒副作用都在可控范围之内。这些结果都激起了大家强烈的兴趣，为后续的发展打下了良好的基础。

吕小松

为什么图片显示不出来，楼主能告知原文是哪里的么？