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生物太次郎87

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发表于 2016-8-4 14:15 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞培养常见问题分析
1、冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？ / e$ v* v7 ^& p+ U+ I+ r9 i4 B) w
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 % {1 x* `9 y& \, c# j. O* |$ ~8 ^
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 3 V5 s% m0 [0 K) X4 ?
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 ! b% u/ t4 f9 S
7、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8、培养基中是否须添加抗生素？ 3 x. _" {3 s; f- n& j' _  n
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 2 K2 I1 s' ^$ X$ b6 u
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？( W9 }3 v' H. x
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 1 O3 D( |* n& E- S) Z
11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？) w' q8 l1 u4 r* `. C5 j2 r0 g' R
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。 6 P" H8 k% ]6 @/ U. m- O
12、细胞之接种密度为何？ ) {' N7 J# B9 L7 C: u
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 - S! k  }3 ^) Z6 x, ^& c5 I
13、细胞冷冻培养基之成份为何？/ M* W6 |+ l* I8 h
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ , d' e5 O% h& |0 Q' r5 A
冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。, W% R4 M8 C% `% @) V3 x0 g
15、冷冻保存细胞之方法？ 7 c( C& S  R4 z0 _
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 * L4 E* {3 Y+ ?; P$ V9 T
15、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？8 v/ o2 {6 R; R. s& Y
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 3 `0 f. `/ z$ a; i" v. t) g9 f
16、应如何避免细胞污染？ ' O5 I" X# i- \1 {
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 4 K9 a' q. r. R1 f4 G4 M
17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。   v  K1 Y! [' T8 J
18、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 7 \$ ^. Y4 t) ^; g* u6 y
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 & q0 o: o: z+ }5 K: f
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？ - _/ ~$ P/ Y/ R# U/ \
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。* E8 [& v# z/ ^
20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 ' O2 d0 w% X0 b% i) w# K: L
21、为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 ℃ 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。
22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？9 }4 \) K; l  a/ a3 c
不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
25、如何选用特殊细胞系培养基？ 3 X: `8 _* e) y; _
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ + a; k. s# Q) ?7 B, F  j: d
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 : {1 ]3 I: `2 `; }. z1 F
27、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
28、什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？) q: s; {0 v( N- j3 F3 T
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ ' `9 A6 }9 C' f* |, m" ^
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
31、书上说，Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
血清9 ~, h8 ?" C8 Z- g- Y8 X$ b5 J7 ~
1、保存血清最好的方法?
建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。1 ]; P2 x, {! A  P0 a
2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?5 F0 J* g# ?- B0 O) P2 |* j' [1 e# c
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。& Y0 A0 |/ o9 _# w
4、为什么要热灭活血清?6 m1 [  }' ?8 M, ^/ Y* v
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。3 z& O- F  A3 i0 L9 U6 I
5、有必要做热灭活吗?9 B- }7 m9 [) {) Y
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。/ M/ q( e6 W+ G( k7 U  T2 U/ H
6、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?" ]  j' H6 v, T/ K8 ^  U' q
GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。: D4 o0 v( ~) M
7、如何避免血清里沉淀物的产生?9 ?6 [1 _" i, u8 f( H
解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。( P7 b9 @* Y+ [+ [/ j3 K/ L/ z
解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。