大鼠BMSC，这个原代的形态如何？

whyme705

新手想请教各位大神们，这样的BMSC形态如何？断断续续养了好几次原代了，感觉每次不是P0就是P1就会老化，心塞# t$ M, G, ~' O- e4 M: U% m

6 m; H& M! F  b" Q5 e这次的BMSC取自150g左右大鼠，全骨髓贴壁法，24h首次全量换液。培养体系为αMEM+10%FBS+双抗+谷氨酰胺。1 T: m- A/ c! j$ d9 z3 f
以下均为原代第4天的图。. R0 F( i* [. r; q% y9 m
感觉很多细胞呈多角形啊) t5 s  E; F3 e6 f2 b! {* y

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+ T" d/ A: |' V5 D另外，有时候感觉原代长得还行，一传代就立马成扁平状了……0.25%胰酶含EDTA，消化控制在2Min左右，还是不行。有没有哪位大神可以不吝赐教？$ B/ h! Y  _# J) A* k7 P) d  O

zhongjianzhj

the cell morphology looks great, Maybe you should add some growth cytokine to maintain the stemness. Usually for mouse BMSC we add some cytokines combination and it can maintain fibroblast morphology to passage 6~8.

fm001982

原代细胞感觉还行。! T* L; i! s8 u  P- Y: A* y
消化有问题。一般用0.125%胰酶消化一分钟左右就行了，边观察边消化，时间并不是固定的，要自己把握。用0.25%胰酶不好掌握时间，不推荐使用。5 |) D- i( d4 W
你的原代细胞本来数量有限，还用0.25%胰酶消化2分钟，酶浓度高，时间长，应该就是消化出的问题。

whyme705

回复 zhongjianzhj 的帖子0 c# f+ v! b' O, U& t5 m

0 {. M- f3 n$ B) Z9 T& @' u3 t谢谢！ 生长因子指的是bFGF吗？

whyme705

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4 D3 j* t) x9 B! g
! U& f/ ~7 n/ ]5 x2 ]7 `  J谢谢！ 可是有时候感觉消化了两分钟有的细胞还没有回缩，看很多帖子对于消化难易程度的说法也是各持己见。是不是这部分难以消化的细胞就不是MSC了？

fm001982

回复 whyme705 的帖子9 A8 s& j( f  O" X

; j! G; q+ S' _# B好吧，我给你细说。
6 ]: o3 B/ w7 [消化时首先让酶液均匀分布，适当晃动，消化30S后，用力拍打培养瓶，显微镜下观察，大部分细胞飘起来了，即可终止消化。; L$ @. e- D: R: y
我一般在37度下放置30S，室温下，一般是25度，边观察边消化，一般1分钟内完成原代细胞的消化。
. _/ {" s8 C3 D4 Q$ n6 W$ Q  J" f5 }9 |% C6 `3 s# C1 X
间充质干细胞有条件就加bFGF，5-10ng/mL。+ A1 p2 B3 T  ]  q) j, H* F

) V0 h3 r8 g2 N7 D9 ]做实验要多问有经验的人，最好能看着人家做一次。

whyme705

回复 fm001982 的帖子8 C. i& _" a9 {8 w9 X( r
8 Y8 m* r- U6 W( J& b6 w
非常感谢你的回答。就是因为周围都没有在养这个细胞的人，所以只能上来发帖问问了。$ L) y# x; z6 r+ `$ _
# ]- o. o2 U8 C/ t7 X8 A1 s" R
昨晚给原代传代了，还是用的0.25%的胰酶，观察到大部分细胞消化好后即终止，整个消化过程也就1min左右，最后一些吹打不下来的细胞就放弃了。但今早来一看，形态又变大了。
4 P- h- s" R7 \2 C7 e' H1 ~# t2 e如果是胰酶浓度的问题的话，我下次稀释一下试试

whyme705

这是传代后的图。。9 l& A& ]/ i1 V. G% ~' q; f1 ]

; n7 C  d5 f: m& e2 G
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fm001982

你这两张图，细胞有损伤，接种密度也可能有问题。

lgfffancy

细胞形态 还行，可以勤换液，等融合度达到90%再传代。
9 c% W0 p, f( H经验之谈。