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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
, d& c- H+ U( B. M: _" M
( G! c& g# m* C. \" M) i. g- { |( T$ D铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
3 N/ S- T: l5 |4 H0 m$ t! \& l0 B, f
: C9 E# }* N: _( r$ T/ w! `4 b; r
实验准备：
W) h5 Z# s/ J) d- @1、培养基：DMEM+10%FBS/ ~1 P, O" ^$ K/ Z8 J, O
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
2 Y0 A9 i- @0 C3、OPTI-MEM （GIBCO）* T7 Q0 J' r0 ^
4、质粒. X# Q* Q% K9 J/ J7 F5 `; k
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
( |7 S- y7 p% M2 Z( [+ E MSCV-IRES-GFP7 U( C! u5 P+ u3 w8 h
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
3 a7 T7 a0 `! [6 o- Z
z$ k9 N6 t1 b5 A9 |实验步骤：& I$ d* l1 O% M8 p5 x6 a, [& n
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。8 ~7 Y+ f" |/ g! n$ x, E U
2、制备质粒-lipo 2000混合液：; W- r( {2 Y" B+ w2 Z- p+ G
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）
9 z. S& |0 h9 Y7 W$ K0 K& n# X: o* Z1 H
（a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
* K9 Y! b) S' R8 a+ T( x （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）
( s9 r1 M! @' N$ ^8 X0 [8 c2 { （c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
( _& V; y6 N, s) E) I （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
4 }/ O$ N8 [9 x; G3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。& }- k) u- ]6 \" X) x' \& W
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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