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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
4 g* a i, x5 k" B2 K* ^$ Q: J" |- Y
: D6 i$ d! P6 P" p% m1 M1 |+ T铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
- X+ _0 R$ _6 s* t9 J+ _! [; L& P& D; U: i+ x6 H# |! {
1 M h5 }. Z Z# @+ X
实验准备：
( }! H7 y) k3 c1、培养基：DMEM+10%FBS* l* G5 E* z+ B) ~0 e7 u: T4 B
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
3 G8 c, h% w, c- Z3、OPTI-MEM （GIBCO）
5 P S7 A) v0 X; S. a" P8 v4、质粒7 l/ f* u, f6 W! o- L0 p% S
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
& O' J; j- C9 G( X- c+ r- v+ p MSCV-IRES-GFP
" S6 P# Z8 o) t/ }2 I( o 两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG+ i$ {0 O1 e! Z+ R( L
: I& W. h2 D) J/ e$ M4 ]$ u
实验步骤：/ v8 R0 f: K B7 ?4 I5 k
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。: k% K) g5 u8 F
2、制备质粒-lipo 2000混合液：
- P6 q. F/ t. h4 X1 f8 i（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）
8 j$ I" h& m5 T! b8 q
2 f. c& ]+ I1 o （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）" Y5 r) V1 S1 [/ o* k. Z) h9 S
（b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）. g+ T7 z. Q. y/ {
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
s/ q2 m* y' F9 f7 ? （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
! A' f, N+ d6 y( {1 k$ Z3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。' _0 G( V! n. `, o) q* H& y: q) J* F
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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