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不才正是李老师门下,偶然看到这个帖子,贴一点我在读期间的实验方法,时隔数年,也许有了更好的改进,请明鉴:
8 y. Z% z+ g5 i# ^7 a1 J% I, a/ k! P" ^. w% k5 L& r3 S
1.1 鸡精原干细胞的分离提取3 j3 X0 i% x% t, R2 f
取孵化19d鸡胚,无菌收集两侧睾丸,置于盛有事先预热的无Ca2+、Mg2+的PBS培养皿中,在解剖显微镜下用尖头摄子去除睾丸的附睾,脂肪垫及其白膜等附属组织后,将睾丸组织分成1mm3左右的小块,在PBS中轻轻吹打3min,静置5min后去上清液。沉淀加入10倍体积的1mg/ml胶原酶I在37℃条件下作用10~15 min,静置2 min后弃上清液,沉淀用胰蛋白酶工作液2ml在同样条件下作用3~5min,移上清液于10ml试管中并加小牛血清0.3~0.5ml(或与消化液相同体积,含有10%小牛血清的DMEM培养液)终止消化。剩余的组织块再加适量胰蛋白酶重复消化一次,倒置显微镜下见有单细胞和细胞团出现即可用小牛血清终止消化,悬液用350目过滤筛过滤,滤液移入10ml离心管中,1000r/min离心8min后吸去上清液。
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