基因编辑，别忘了还有 ZFN 和 TALEN

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基因编辑，别忘了还有 ZFN 和 TALEN
* r; S3 g1 e( \4 l9 E7 u+ F来源:生物通 / 作者: / 2017-07-17' X8 t0 y2 ^0 K6 i; d: [' R( d+ P# x
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基因编辑对生物医学研究的影响不亚于 30 年前的 PCR。近年来，锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应子（TALEN）和规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）已经掀起了一浪又一浪的基因编辑高潮。
% m! g: j3 H/ Q; {; h从时间上看，ZFN 是最早的，接着是 TALEN，最后是 CRISPR。每一次成功的交替，都伴随着操作更简便、应用更普及。CRISPR 的出现，大大简化了基因编辑的操作，因此被研究人员广泛采用。
2 S3 t5 i' f3 l& {尽管如此，ZFN 和 TALEN 仍被人们认为在基因治疗中前途光明，因为它们比 CRISPR 更加精确。Schaefer 等人近期在《Nature Methods》上发表文章，通过深度测序揭开 CRISPR 的脱靶效应。作者指出：“我们发现了大量意想不到的单核苷酸变异，而不是像人们普遍认为的那样，CRISPR 主要在与 sgRNA 同源的区域产生插入缺失。”1 P9 B. p! b# S& H. y* \
“CRISPR 的简便让基因组编辑迅速普及，改变了疾病研究的面貌，”MilliporeSigma 的基因编辑负责人 Martha S. Rook 博士谈道。“然而，对于那些需要知识产权专利的关键研究，成熟的基因编辑技术（如 ZFN 和 TALEN）仍然是首选方法。”+ n; `3 n8 J7 Z6 ]
重回 ZFN？& _8 h+ r/ u2 W2 X, q7 \) m
CRISPR 是依赖基因靶向的向导 RNA 来结合特定的序列，而 ZFN 则不同，它是由蛋白构成的。这些结构域蛋白经过优化，可提高精确度和特异性，适合临床基因编辑。. i+ t5 \/ l% X( V  f
据 Sangamo 的副总裁 Michael Holmes 博士介绍，ZFN 需要的蛋白改造知识比 CRISPR 要多。“这也就是为什么研究人员在考虑基因编辑时，第一时间想到 CRISPR，但对于治疗而言，最简单的也许并不是最好的。”
+ i4 b3 N3 C, n% Y( m, w4 d2015 年 12 月，美国 FDA 批准了 Sangamo 的 B 型血友病治疗方案（SB-FIX）。这种方案是在患者肝脏细胞的白蛋白基因位点中插入治疗基因。“当我们将治疗基因插入这个非常强大的启动子时，我们能够将肝脏作为蛋白生产工厂，这样只需要编辑少量肝细胞就能产生治疗水平的蛋白，”Holmes 说。% r% p1 R) z+ G7 f. R9 X! \
这种经过优化的 ZFN 有着出色的特异性，且脱靶修饰的水平低于深度测序的检测极限。“在基因组指定的位点获得 80% 以上的编辑效率，且脱靶效应低于检测限，这种能力正是治疗性的基因编辑所需要的，”Holmes 补充说。  T% ]6 P- D5 {% _3 A; g$ q* A
Sangamo 的锌指平台对基因组所做的修饰在遗传上是稳定的。试剂的作用是瞬时的，但它们赋予的性状却是永久的。“天然的进化动力当然存在，这会导致细胞在许多代后不分裂，或丢失染色体。不过，它与未经过编辑的基因组相比既没有增加，也没有减少，”Holmes 解释说。
1 T* T1 o& Q$ yProxy-CRISPR5 j% D2 X6 [& s1 C
当然，CRISPR 在许多应用上还是具有独特的优势。Rook 认为，CRISPR 设计简单，让研究人员能轻松获得现成的 CRISPR 全基因组文库。此外，与 ZFN 和 TALEN 相比，它的切割效率提高，也增加了其在全基因组筛选和单个靶点编辑中的应用。
6 G- r/ f* g# d% u. G' n, i7 }MilliporeSigma 最近宣布对 CRISPR 进行改进，以便让这个工具更加高效、灵活和特异。他们将利用 Proxy-CRISPR 来接近那些之前无法触及的基因组区域，从而加速药物开发和基因治疗。这种方法最近表达在《Nature Communications》杂志上。
1 Z+ V8 ~* h& nProxy-CRISPR 利用 CRISPR 的两次结合来实现高效切割。第一次结合是利用缺乏 DNA 核酸内切酶活性的 Cas9；第二次是通过同样无法单独切割人类 DNA 的 CRISPR 系统。据 Rook 介绍，这种策略是模拟天然存在的现象，因为许多不同的 CRISPR 系统与不同的 DNA 序列结合。
+ K. [9 b1 E( i7 O$ e" U' i4 u2 UProxy-CRISPR 允许 DNA 靶点是多样化的，就好像许多个体的致病位点都有所不同。“为了纠正各种可能的致病突变，这就需要编辑技术能够靶定几乎所有的 DNA 序列，”Rook 谈道。“Proxy-CRISPR 方法为使用各种 CRISPR 变体打开了大门，它们能够揭开基因组差异的意义。”6 \! {2 }* v9 v. l1 ~$ o
灵活应用
6 V: d. x* q+ Y7 N5 A0 q; o' QPoseida Therapeutics 也发现，CRISPR 技术的改进能够克服脱靶效应。这家公司最近发布了临床前数据，表明它家的高保真基因组编辑系统 NextGEN™ CRISPR 可以产生“万能供血者”嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）。大家都知道，这是癌症免疫治疗的重要平台。
. s) \* n0 c, ?Poseida 目前已经积累了多个基因编辑平台。除了 NextGEN CRISPR，Poseida 还采用 piggyBac™ DNA 修饰系统、XTN™ TALEN 位点特异核酸酶以及 Footprint-Free™基因编辑。
7 X; ?; z' c5 ^# u, t0 _“对于不同类型的细胞而言，没有一种永远无敌的技术，具体要取决于你想做什么，”Poseida 的 CEO Eric Ostertag 说。“CRISPR 试剂设计起来更简单、更快速，比 TALEN 也略为便宜。但是，如果你有 TALEN 的经验，并且打算上临床，那么成本和设计上的差异几乎可以忽略不计。”
. b3 w1 T- T# L; Z: INextGEN CRISPR 的优势在于它可以应用在活化和静息的 T 细胞，这与很多只作用在活化细胞上的技术相比就具有更大的灵活性。Ostertag 表示：“干性表型对产品效果和持续时间都是至关重要的，因此我们倾向于改造静息细胞。”NextGEN CRISPR 在静息 T 细胞上效果很好，但 TALEN 不行。
$ ~( J; q/ I3 G" V% P5 j5 W野生型的 CRISPR 利用 Cas9 蛋白和向导 RNA 来切割 DNA。作为天然的核糖核蛋白，它的切割效率很高，但非常马虎，带来一些不想要的脱靶突变。Poseida 的 NextGEN CRISPR 则使用了类似锌指和 TALEN 的核酸酶，需要两部分同时存在才能切割，从而保证了 on-target 的特异性。3 K) d. \6 f* K' z+ o+ }7 T