人外周血分离出内皮祖细胞的培养

大头娃娃宝宝

我想做人外周血内皮祖细胞通过流式细胞仪检测计数，实验步骤是这样的：抽取外周血3 ml ,抗凝,血标本用PBS 液2 倍稀释,取3ml的淋巴细胞分离液，加入一个新的离心管。用滴管吸取稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面。盖好盖子，用封口膜封好，2000rpm/min 离心30min。离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白色雾状层，含单个核细胞。用吸管小心并直接插入到单个核细胞层并吸取白色雾状层，收集到另一试管中。加10ml 生理盐水稀释分离的淋巴细胞，2500 rpm/min,离心10min,弃上清。重复洗涤1-2 次，除去血小板和抗凝物质，细胞计数，用RPMI1640 培养基调细胞数至2×106 个\ml，移至6 孔板（或细胞培养瓶）中培养（竖立培养）加入10%胎牛血清、1%IL（20ul\ml ） 、1%双抗（青霉素和链霉素），摇匀。5%CO2 培养箱37℃培养。然后加入抗体，流式检测。
' J  G! w8 |# ]/ Y但有的老师说关键是怕无法获得2×106 个\ml的单核细胞，细胞数不够的话就无法上流式检测。那个1640培养基只是保持细胞不死，因为是原代细胞，不是细胞株，所以不会生长很多。+ i! [4 e/ y! r% d. y1 o
请问大家有好办法吗？

baichunyu

1# 大头娃娃宝宝 8 o, O& B8 v4 w$ ]8 R3 {  P* X4 Z
选择适合EPC生长的培养基，关键是生长因子的选择，几种生长因子选择好就可以了，养EPC是需要大量经费做后盾的

大头娃娃宝宝

我不养啊 只是想在分离后得到得到足够的细胞上流式细胞仪检测 3 N% p# y  {0 j+ x" n# {3 b
有没有什么办法啊

tianangelt

回复 3# 大头娃娃宝宝
2 ^) v  p0 T; P& W9 |2 D. J1 }& P. A$ i/ h& W
只能是多准备点血液，或者提高分离效率了。

wzx6660

学习了

我爱光明2009

你这是要检测内皮祖的表面标志嘛？如果你不养细胞，只想收集足够多的MNCs，那么建议加大离心力，洗涤次数最好一次，获得的细胞数会多一些。如果要培养内皮祖，那么就得洗干净，分离液和抗凝剂都会影响生长。此外，因为分离出的是干细胞，可加干细胞生长因子，促进其增殖！

benben

建议直接裂解完红细胞就上流式

新手

回复 7# benben 5 d8 t1 @+ X* O# \" c% A3 u
5 m3 _2 q" D( F. q! x$ v

3 m; H" b/ J8 Z    我目前也准备做人外周血内皮祖细胞的培养，但是实验室老师说经过离心后，血液就会被污染，后期的培养就不能做了。请问你们是怎样做的？

benben

我是裂解红细胞直接上流式