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第一，盖玻片需过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当一张，一定看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不接触纱布，否则会粘上毛毛的。然后压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。
/ o( Z/ h! O, ]8 j+ ]第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至重，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
# c, t5 L0 t: O' H, m6 F, ~第三，传代消化下来的细胞一定不过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。" K/ `1 A7 R' u4 n
第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。/ Z8 ?, T1 r v% u8 t
第五，将玻片拿出后一定记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切长方形的。目前市售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改长方形，至在某个角上用砂轮做个记，理论上很简单，实际操作有难度。
6 g# N. C1 M7 {) k第六，上面步骤都没问后，玻片就需进一步处理了，这里有几个细，分述如下：% f& x/ b; Q/ M! s. Y6 v8 V* n5 I! [
1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！
, O4 k5 d/ B( o3 P2 j( K. v8 k) A7 f2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。我发直接用4°C的溶液会造细胞冷休克，从片上脱落。- P& _- D4 M+ V2 H0 m# [% }
3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时，尽量少滴树胶，一点点就够了，而且至少半个小时以上才能粘牢，防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动，背面会出树胶的印子，镜下很难看，而且擦不掉的。
% T4 P/ P4 O, f1 @( ^4.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒没怎么试过，我基本上做好的就直接做免疫组化。
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多聚赖氨酸，这个在爬片中比较常用，可以根据需要调节浓度。细胞表面及细胞外基质中的FN分子间通过二硫键相互交联，组装成纤维。纤粘连蛋白与胶原不同，FN不能自发组装成纤维，而是通过细胞表面受体指导下进行的，只存在于某些细胞（如成纤维细胞）表面。转化细胞及肿瘤细胞表面的FN纤维减少或缺失系因细胞表面的FN受体异常所致。$ h7 r3 T$ G6 r& g/ O
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发表于 2010-9-17 08:48
