纯化原代细胞（除去原代杂细胞）的方法除了连续传代之外，还有另外的可行的方法没有？

mominglily

请问各位前辈：纯化原代细胞（除去原代成纤维细胞----MEF细胞的杂细胞）的方法除了将细胞连续传几代之外，还有另外的可行的方法没有？多谢！

liutianzhu

就正常4度消化 机械破碎后纱布过滤就行了

liutianzhu

有人用转板的方法，利用成纤维细胞贴壁快（15min就开始贴壁）的原理去除成纤维细胞，而要获得的实质细胞贴壁较慢

liutianzhu

1、自然纯化5 Z( {$ m# x# r+ s8 i: s5 O& M# j

7 A9 U, @; |, k8 W) J即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。
0 _  T0 k, A% Z3 L" i  u$ Y+ n4 R' `4 R
2、人工纯化
' z/ _) y) b$ O1 X& K0 `# [9 c8 ^9 C6 E
（1）酶消化法
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在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
; T7 `3 a2 _4 K. b; u4 a5 ]4 G6 \+ ]  K( D  K- a) a; C+ R) w
（2）机械划除法: I! t5 j9 A3 G& z

0 \9 Q0 b, A0 w/ j0 n原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。5 d( U0 A% g/ z; W$ w* a5 e& q
, P" N( F9 ^) a! f
（3）反复贴壁法
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3 }$ o: u: H0 e, g6 F; x8 K( ^  r成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。# K* h1 ~! t7 J) F0 k0 {
; P5 ]; |/ O; A' m& {8 h
（4）克隆法* t7 ?4 C3 l( U) u1 H9 W5 ~
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采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。& M; B, m: D- Z2 Z
' r7 u: V8 U' H# p" }
（5）培养及限定方法
* d" C  m) G2 Q! c  _
0 F% `; H: e8 i2 M- J/ n某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。% E9 p* o2 z5 z( t/ j

1 \8 b* {' h, |* S- r$ K9 s（6）流式分选 / G% V5 r# D+ Q. J6 h5 k( Y* b
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brdu6 P; g- o& H# W  |: g2 |
. ^  O. ]0 C/ M/ |. _  t9 L
【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的. G2 m, d. {5 K! i+ a# n5 a" C

; |) {  J4 g* h- P' k# q* X【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想5 Y1 @. d; P% E5 O+ k$ e

6 m& I1 o4 U4 r" ]( O【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。" I* X3 S# ~& K

; Y% R3 w6 F2 B- o  ]1 E【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞3 N; T* f+ u1 }

8 I/ z! G. P$ S5 G  @【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu用多大的浓度？
3 @- q. q- L5 k5 m, S8 {1 q( J7 B1 V2 w
【cheerfulness】养心肌原代 最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu! \7 _; e' g; s, X5 O& P9 ~) k8 ~

. h( K5 j' G' c) w* M/ ?【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响

mominglily

回复 4# liutianzhu
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! C5 r, u8 l9 P) k# J. l( K+ @* C! T8 |8 x3 Z! r% B% w' F
    谢谢您给的答案，但是我想问的是刚通过手术分离出来的原代胚胎成纤维细胞的除杂，而不是PMEF和其他类型细胞的分离纯化。