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人来源脂肪干细胞的培养
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9 y4 G. d- T7 K1 N9 r- v3 S6 E4 I1． 脂肪干细胞原代培养
8 S( x m" I4 x% A$ g9 h# }1) 取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。
0 y" E5 V& }3 \0 T. s2) 吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；0 O% U1 n" s" S/ ]$ `
3) 向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；
% Q C' ?: M+ ?# j* _4) 吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；+ f3 S, L6 y1 B) a$ s J/ A
5) 用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；
7 x' v: l" I/ P8 D# x6) 在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；
4 w& N5 I" V7 w" a) u5 `1 Q7 g+ w6 Z$ a2 u7) 第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。5 [$ g9 W5 t; ?% P
2. 脂肪干细胞传代培养/ Q* a) D* Q4 ?. G4 [( l$ k
1) 在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；
* _, ~- z3 }. p; q5 W$ }2) 培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；
9 U8 K9 j0 C4 w/ R8 X3 W3) 用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；) K% Z; B8 }2 I# P) ]/ V8 F; A- Y
4) 将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；
: `! @6 d" I! E% f5) 显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。9 ~5 m: |4 S, y) L6 ?; i
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3. 脂肪干细胞的冻存
: T" i/ L ]" ?( Q# O% L6 k" X 将传代培养的细胞悬液以1×106cells/ml的比例加入预冷冻存液（含5% DMSO，30%胎牛血清的DMEM），充分混匀后置预冷的冻存管中。将冻存管置于-80°C低温冰箱中过夜后，投入液氮中保存。
0 ^. f7 S. ~2 X& G& I; ], G; ^" }4. 脂肪干细胞的复苏
: Z9 ~ {: K0 J7 `6 _( S5 m) t2 |1) 取出液氮中的冻存管，迅速投入37°C水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，复温在1-2分钟内完成；
; M- `, T' b; z- X0 t7 V' h3 w2) 用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染； ^8 V4 Y! v8 \! A- h. u, b& `
3) 无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中，补加4ml培养基后离心(1000r/min, 5min)，弃上清；% W2 ~2 ?8 m$ y; n
4) 收集细胞，用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中，于37°C, 5%CO2培养箱中培养。 |
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发表于 2010-3-22 11:46
发表于 2010-3-22 12:35
发表于 2010-11-17 14:49
