关于骨髓间充质干细胞的疑问

孙小牧

刚开始做细胞实验，按照丁香园里原代细胞的protocol操作的。
; A/ l$ `6 S7 \" w- ]. t目前做了三次，每次都是完全培养液冲出骨髓，加到2倍体积分离液中离心之后，只分两层，没有像文献里说的那样分四层。
3 s  X. e' a* z1 k0 p" ~2 o0 [$ d想请教一下各位前辈，可能的原因是什么？$ _( j8 T! G6 G# Q; B
分离股骨胫骨，完全培养液冲骨髓的操作应该没有问题。分离液是GE 17-0891-09的percoll细胞分离液。每次都是两倍体积分离液在下，缓慢加入冲过骨髓的培养液。1 X+ Z4 u. N1 r: U1 u

iytbxxg

白细胞层本来就是很少，别把这一层忽略了。

孙小牧

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! R0 u- e- {( W4 D, N/ D4 S4 T% l8 q4 A  a# I  U
做了三次都看不到白膜层，不知道是不是自己冲出来的骨髓太少，还是别的什么原因

卓俊文

骨髓量少，试试1:1

孙小牧

回复 卓俊文 的帖子$ Z6 M* j1 g/ O6 [: p# T+ B

4 L& }; M9 s; t' n, X2 F! O3 W& i谢谢指点

cmw930922

我个人觉得全骨髓法很实用，而且我不离心，直接把骨髓悬液冲到培养瓶中，效果很好。以下是我的方案( r, r* ^5 p& [7 s" G
原代培养步骤
0 }4 D$ M# M6 _3 k2 m7 |$ ?        1. 小鼠（3周龄）在水合氯醛下麻醉后处死，取双侧股骨、胫骨（保证骨头两端完好，去净肌肉组织），将完整的股骨放入含1%双抗的PBS中，将装有骨头的50ml离心管（一管30ml能装4、5根）放在泡沫箱（有冰袋）运输。
/ W6 J- L- }% l        2.消台20分钟，准备T25培养瓶，60mm培养皿，原代器械盒（外科手术剪，镊子，血管钳，15ml注射器）
5 U+ j  Z4 ]+ `8 x        3. 先将股骨浸泡在75%酒精3min，取出后PBS冲洗3遍（完全去除酒精），血管钳夹持股骨，手术剪剪去股骨两端骨骺，用5ml注射器抽取全培穿刺冲洗（一根骨头一只注射器），直接冲入tT25培养瓶（2ml培养基）（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗）。
+ ~2 g9 N! ^) X        4. 48h后全量换液（期间不要剧烈摇晃培养瓶）
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