片段总连不上

xinxin

大家好！
, a: `8 m, G, V4 X' J6 w8 ?我有个问题很困惑，我有两个双酶切（Ecot22I/AflII）的片段,一个3K多，一个6K多，试过去磷酸化，和连接试剂盒，但都连不上，不知是何原因。恳请 各路高手赐教。

ghfvcat

详细点，你具体是怎么做的？连不上是什么意思，连接错误的片段，全部载体自连，还是根本没东西？& t1 U6 }7 I; d) e8 t, a
实在连不上来，就辛苦一点，每一步做个对照，排查原因。确定操作和实验设计没有问题后，换一个试剂盒。有时试剂盒也会出问题

xinxin

哦，就是每次连接完还是跟6K那个没有双酶切的质粒差不多大（所以我认为3K多的片段没有连进去）。双酶切的片段大小都对，就是3K多的片段进不去。

ligangcw

你看看电泳时用的的marker电泳条件可以分开6000和9000的片段不？

可怜的孩子

送去测序看看

ghfvcat

回复 3# xinxin
) R! [$ _+ P! g0 J
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; _' v6 Z, t+ C( q; I* l0 D6 S    双酶切的片段大小都对？是没切鉴定时候对么？那不就是连上了么，不能从质粒的大小来看目的基因有没有连上，质粒和线性DNA泳动速度不一样

hljzyydx

个人认为应该从以下几个方面考虑
1 i' Q5 v4 b' ]3 k7 d3 o" N0 G1.先重新看一下实验设计，确保酶切位点是一致的，且是单酶切位点& i% |6 T4 g/ ~! v$ ~
2.观察以下BUFFER，双酶切的BUFFER是与两种酶单用的BUFFER不同的
; T; V5 J: V% z3.调整链接体系和反应条件，尝试在体系中提高片段含量。此外，试试更改T4连接条件，听说有16°过夜的，也有4°的反应条件（我只用过16的）。改变以下试试
" u6 `% I) ^3 v! _2 n1 g8 L4.实在不行尝试分步单酶切9 ]% w& P5 _' O
( {) B1 I2 Z0 P! T( V8 O/ w
我能想到的大概这些吧。。

tspaulzhao

你的外源片段不大也不小，而且在双酶中选择了两个不太常用的酶，建议你是否换另外的酶试试，此外，不知你是否用过商业的感受态细胞？有时如果感受太不好，即使连上了，也不一定转进去。同时，也请注意，酶切时间不要太长，有些酶切的时间太长，会破坏切点结构。如果实在不行，可试一下先放在中间载体上，最后转到终载体上。