片段总连不上

xinxin

大家好！) n0 v8 J6 u7 i# k0 ]+ w/ N, A
我有个问题很困惑，我有两个双酶切（Ecot22I/AflII）的片段,一个3K多，一个6K多，试过去磷酸化，和连接试剂盒，但都连不上，不知是何原因。恳请 各路高手赐教。

ghfvcat

详细点，你具体是怎么做的？连不上是什么意思，连接错误的片段，全部载体自连，还是根本没东西？: J1 p1 P( L" T2 I
实在连不上来，就辛苦一点，每一步做个对照，排查原因。确定操作和实验设计没有问题后，换一个试剂盒。有时试剂盒也会出问题

xinxin

哦，就是每次连接完还是跟6K那个没有双酶切的质粒差不多大（所以我认为3K多的片段没有连进去）。双酶切的片段大小都对，就是3K多的片段进不去。

ligangcw

你看看电泳时用的的marker电泳条件可以分开6000和9000的片段不？

可怜的孩子

送去测序看看

ghfvcat

回复 3# xinxin 0 ^- {: Q5 K7 ~) t- D4 w
: S( O3 d- w0 k/ A4 V6 [2 B

4 B; ^5 `( R' |3 ^* Z    双酶切的片段大小都对？是没切鉴定时候对么？那不就是连上了么，不能从质粒的大小来看目的基因有没有连上，质粒和线性DNA泳动速度不一样

hljzyydx

个人认为应该从以下几个方面考虑
, C0 ~3 V$ G+ g9 `  U0 ^1.先重新看一下实验设计，确保酶切位点是一致的，且是单酶切位点7 k, H: C. R1 m' k5 [' e
2.观察以下BUFFER，双酶切的BUFFER是与两种酶单用的BUFFER不同的
9 G; W" K0 W- Q0 ~) ~, A. w3.调整链接体系和反应条件，尝试在体系中提高片段含量。此外，试试更改T4连接条件，听说有16°过夜的，也有4°的反应条件（我只用过16的）。改变以下试试- Z- v( V# d0 [, }+ y1 Y9 @; b$ v
4.实在不行尝试分步单酶切2 P( {6 k9 i# h. A! T, Z

5 I1 n8 o7 J% G9 @: k8 t4 q# D我能想到的大概这些吧。。

tspaulzhao

你的外源片段不大也不小，而且在双酶中选择了两个不太常用的酶，建议你是否换另外的酶试试，此外，不知你是否用过商业的感受态细胞？有时如果感受太不好，即使连上了，也不一定转进去。同时，也请注意，酶切时间不要太长，有些酶切的时间太长，会破坏切点结构。如果实在不行，可试一下先放在中间载体上，最后转到终载体上。