无血清培养扩增临床规模人骨髓间充质干细胞

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无血清培养扩增临床规模人骨髓间充质干细胞! I8 o0 q& W5 M' q- c; i' M; M
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【摘要】  目的  体外培养扩增临床规模的人骨髓间充质干细胞（BM-MSC）。方法  骨髓单个核细胞(MNC)来自10例正常人及9例恶性血液病患者，采用无血清培养基体外培养人BM-MSC，流式细胞术（FCM）进行BM-MSC表面标记及细胞周期分析。结果  经4周培养，细胞数平均可达7.59 (1.0~14.2)×107，纯度可达95%以上，1.2%的细胞处于S/G2/M期，其余98.8%则处于G0/G1期。结论 应用无血清培养体系可培养扩增临床规模的人BM-MSC 。+ t, U: c+ v1 y( u$ M! k1 A8 L) j
【关键词】  骨髓间充质干细胞 扩增 细胞培养 无血清2 P/ P" ?0 W# R1 b

: p, z+ C! A! o0 NClinical scale expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro in serum free media MENG Lijuan, LI Jianyong, XU Wei, et al. Department of Hematology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China: K0 Q0 X' a! Q5 O
【Abstract】  Objective  To explore clinical scale expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells(BM-MSCs). Methods  Bone marrow mononuclear cells(MNCs) were obtained from  10 healthy donors and 9 patients with hematologic malignancies and MSCs were expanded in vitro in Mesencult serum free media. Cell surface immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Results   MSCs were expanded in vitro for 4 weeks，the median number of MSCs were 7.59 (1.0~14.2)×107.The purity of BM-MSCs was over 95%. Cell cycle analysis showed that 1.2% of them was in S/G2/M phases and others were in G0/G1 phases. Conclusion  Mesencult serum free media can generated sufficient BM-MSCs for clinical purpose.: M# y. Q5 Q' C  f% d
【key words】  Bone marrow mesenchymal stem cell  Expansion  Cell culture2 a# }$ W2 W0 c: I2 A7 q
Serum free media2 ?) Y( k' F* [7 j5 V
骨髓间充质干细胞（bone marrow-mesenchymal stem cell,BM-MSC）是骨髓中除造血干细胞（HSC）之外的另一类具有多向分化潜能的原始细胞。临床和实验研究表明BM-MSC联合HSC移植可明显加速HSC植入[1-3]。MSC还能抑制T淋巴细胞增殖[4-5]，可应用于造血干细胞移植时移植物抗宿主反应（graft versus host disease,GVHD）的预防和治疗。MSC有着非常广阔的临床应用前景。但骨髓中间充质干细胞含量极少，约占骨髓单个核细胞（mononuclear cell,MNC）的0.002~0.005‰ [6]。为了得到足够数量的BM-MSC以应用于临床，并避免含血清培养中病毒等病原体污染的可能，我们开展了无血清培养系统扩增BM-MSC，现将结果报告如下。
& U) K! \) m" B# F* c2 F' o对象与方法
- b- P1 _" A& m( C& I一、        对象% d  y* f# I6 I% t& k: p9 C! }
骨髓标本采自10例正常供者，男2例，女8例，年龄30~50岁，平均42岁； 9例拟进行自体或异基因造血干细胞移植的患者，男7例，女2例，年龄15~69岁，平均40岁，其中非霍奇金淋巴瘤（NHL）5例，1例有骨髓浸润，余4例无骨髓浸润；急性非淋巴细胞白血病（ANLL）M21例、M33例。NHL患者接受CHOP、MINE等方案4~8疗程，AML接受MA、DA等方案5~9疗程。
( m. Z1 _) W9 c- i; a二、        材料
6 a# G: v( m: K' SDMEM-LG培养液（Gibco公司）；MesenCult培养液（Stem Cell Tech公司）；0.25%胰酶（Difco公司）；二甲基亚砜（天津市灏洋生物制品有限责任公司）；￠100mm培养皿及刻度移液管（Falcon公司）；10×PBS（Gibco公司）；分别标记PE、FITC、CD105（SH2）、CD73（SH3，SH4）（BD Biosciences-Pharmigen公司）、CD20、CD10、CD90、HLA-DR、CD13、CD133、CD34、CD45（Immunotech公司）；DNA-Prep Counter Reagents Kit(Beckman-Coulter公司)
& ?8 }! @9 y; k" X0 H9 h) t9 i三、方法" D  T3 M3 C7 h
1. BM-MSC的采集及体外培养：无菌操作下取胸骨（或髂前上嵴、髂后上嵴）骨髓液15~30ml，肝素抗凝。在达《药品生产质量管理规范》（GMP）要求的实验室内：向骨髓中加入DMEM-LG稀释，用1.073g•ml-1的Percoll液（Pharmacia公司）900g离心30min，分离MNC，将收集的MNC用DMEM-LG洗2次，计数并调整细胞浓度，按（2~5）×106ml-1接种于培养皿中加，入MesenCult培养液至终体积10ml，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中。24h后弃悬浮细胞，加入新鲜MesenCult培养液。待贴壁细胞80%~90%融合后用0.25%胰酶消化，按2×105皿-1传代。细胞冻存采用10%DMSO、20%人血白蛋白、70%DMEM-LG体系，4℃30min，-20℃1h后转移至-80℃低温冰箱。冻存细胞浓度为（1~5）×106ml-1。在40~41℃水浴中1min内完全解冻，用预冷的MesenCult培养液稀释离心，弃上清，使细胞重新悬浮于培养液中按2×105皿-1接种。$ g5 ?7 y0 _! V+ b
2.BM-MSC的表型鉴定：0.25%胰酶消化采集细胞2×106个细胞，免疫表型分析采用四色流式细胞术（FCM,Epics XL型,Beckman-Coulter公司）。
! D5 X# ^: }) M7 i0 v7 N9 T4 i3.BM-MSC的细胞周期分析：0.25%胰酶消化采集5×105个细胞，1ml70%乙醇固定过夜，应用FCM分析。上机前离心弃乙醇，PBS液洗涤细胞2遍，加入DNA-Prep LPR和DNA-Prep Stain，室温闭光30min。应用Multicycle for Windows软件分析结果。" n# x* U( e$ S% Q" t' {
结   果% a1 f- Y, x, f
一、BM-MSC的分离培养：应用Percoll液（1.073g•ml-1）梯度离心（900g×30min）能成功的从常规化疗后的患者及正常供者骨髓中分离出MNC，生长出BM-MSC。分离出的MNC72h后出现贴壁的纺锤状细胞，4天左右形成克隆，此时细胞稀疏混乱，两极朝向不规则；培养一周末，开始呈现有规则的集束辐射状。至2周末，各分散集落互相汇合，即可传代，传代细胞15min即开始贴壁。之后约每周传代一次。达80%~90%融合时每培养皿可产(8-15)×105，至2-3代，约4周体外培养，细胞可达7.59 (1.0~14.2)×107（见表1、表2），纯度达95%以上。本次研究有4例（供者1、供者10、患者4、患者9）经4周培养，未达目的细胞数，经再次传代可达相应数量；4例（供者4、供者9、患者1、患者5）未获成功。
: @2 ]+ i/ B' x: |; k9 R4 }* L讨  论0 a* S7 C  G. E8 I. \1 I3 |
19世纪中叶，人们就发现骨髓具有造血以外的功能，直到20世纪后期，Friedenstein等证实了BM-MSC的存在，并创建了体外分离培养BM-MSC的方法。此后，关于BM-MSC的研究逐渐深入。/ R! u5 l$ B* F7 a0 Y
BM-MSC的培养方法很多，根据有无血清可分为有血清培养和无血清培养两种。应用无血清培养体系扩增临床规模的BM-MSC避免了含动物血清培养过程中可能的未知病毒等病原体感染人类，可以更安全的应用于临床，但价格高昂。
" d# E3 I2 F0 l$ I3 }采用本实验的培养方法，11例（57.9%）成功地在短时间内(约4周)从常规化疗后的患者及正常供者的骨髓中分离并培养出临床规模（ (1~2)×106kg-1）的BM-MSC，并且培养过程中未观察到两者间有明显的差异。BM-MSC的形态学特征、生长方式、培养周期等与文献报道一致[3]。FCM检测细胞表面标记表明扩增后细胞表达其表面特有抗原分子(CD73、CD105等)，而不表达血细胞标记（CD45、CD34、CD38、CD33、CD10、CD20等），排除了可能的血细胞污染；细胞周期分析表明98.8%的扩增后细胞处于G0/G1期，保证了所培养的细胞仍保持干细胞特性。因此，我们体外培养扩增的细胞在数量及质量上符合临床要求。$ u( \3 q, T0 @$ A
本次研究有4例（21.1%）未获成功，原因分别为：4 x2 h% i6 `9 e, ?. D
1、        1例因细胞层流室医用净化空调故障加之长期紫外光消毒导致环境质量下降致使所培养细胞分化，胞体变大，分化增殖活性明显下降。
% C& r$ f# n9 F: {% N1 q" h2、        1例细菌污染。2 @( q: U, Z8 _# r) k) p, ^
3、        1例冻存后复苏，细胞损伤较多；可能与细胞冻存的时机、冻存复苏过程中的细节操作不慎有关。4 L2 h, Y+ y1 w/ Z5 c; c
4、        1例可能与骨髓液稀释致MNC中间充质干细胞含量较少有关。
$ n1 S/ f) G4 J$ x+ X我们在研究中发现0.25%的胰酶中加入0.02%的EDTA后胰酶的活性明显增强，表现为消化时间缩短（37℃，≤2min），但死细胞增多。故本次实验除极少部分的细胞外，余均采用0.25%的胰酶消化传代。细胞回收时，由于细胞较多，我们采用现配胰酶应用液的方式来提高工作效率。0 \0 ^) }& G4 i5 [& F. q; t. e

& s$ R! r" z3 g参 考 文 献% `" i& r3 K+ p2 ^# h
1 李建勇,吴汉新,任志宏,等.异基因间充质干细胞和造血干细胞联合移植治疗难治白血病的初步临床研究. 江苏医药,2003,29:759-761.7 r( O; g# V) P7 l
2 陆化,李建勇,汪承亚,等.自体骨髓间充质干细胞和外周血造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤.南京医科大学学报,2003,23:63-64.
3 J3 {: e- |* @! X; W3 Koc ON, Gerson SL, Cooper BW,et al.Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemothyrapy. J Clin Oncol,2000, 18: 307-316.9 j) P; c$ T! y
4 Tse WT,Pendleton JD,Beyer WM,et al.Supression of allogeneic T-cell proliferation by humen marrow stromal cells:implications in transplantation. Transplatation,2003,75:389-397.- }! r+ n! }% E3 |+ ~4 D* S
5 Le Blanc K,Tammik L,Sundberg B,et al.Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responces independently of the major histocompatibility complex.Scand J Immunol,2003,57:11-20.
! c. O4 G! _( N6 Koc ON, Peters C, Aubourg P,et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells remain host-derived despite successful hematopoietic engraftment after allogeneic transplantation in patients with lysosomal and peroxisomal storage diseases. Exp Hematol,1999, 27:1675–1681.

menghy

谢谢分享！！

tu2008zi

谢谢

beidouhan

谢谢，学习了