大鼠MSC细胞是不是老化了？（请各位帮看看图）

hzs7918

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( ~4 C/ S  X/ q, G/ g# |& `最近三个多月来，SD大鼠的骨髓间充质细胞原代培养一直有问题。快要崩溃了，我用的是全骨髓培养法， SD大鼠4周到3月龄，一般1只大鼠骨髓铺15cm dish一只，10cm dish也试过。 血清用过atalanta的也用过sigma的FBS， 10%，15% ，20%都试过，培养基是IMDM。72hr 首次换液，也试过24h首次换液。以后三天全量换液一次，7-9天传代。  r3 x. `7 q4 N, x& {; O
原代细胞僵化，很难消化下来，sigma 0.25%的trypsin-EDTA 37度 预温消化8分钟，至少有1半消化不下来。 P1代细胞肥大成圆形铺开，颗粒增多，停止生长。fig1. 100× 是P0 7天后传代的day2 的图。 这是200×的图。可以看到有些梭形的细胞，其中有很多圆形铺开，内颗粒较多，生长停滞的细胞。 苔芬兰染色，细胞拒染，说明还是活细胞。这些细胞是老化细胞吗？那些梭形的细胞传到4代左右就越来越大，多角形，也不增值了。
( N' _" I  z/ w
$ E) o! s$ n' o0 I* s请各位给我看看，到底是什么原因，MSC的原代就一直培养不好呢？

meirongwan

胎牛血清应百分之十多了容易老化活力好四五代细胞活力稍差四十五天细胞自然凋亡

hzs7918

谢谢meirongwang， 我也注意到这个问题，这批细胞是10%的hyclone FBS+highg lucose DMEM,还是这样，三代的是时候还是这个样子。不知道问题在哪里？

茶水

抽骨髓时，用点肝素润滑下注射器，培养基用DMEM/F12 低糖/10-6维生素C，首次3天半换液，后每3-4天半换，一周左右1：3传代，一般能传5代就够了，后面的有的不好做。

angel-sakura

我也跟你出现的情况一样，也是细胞变宽大，消化不下来，是细胞老化，我做了衰老染色。估计是分离时间过长，建议操作快点，此外，最好不要全换液。。

cwroots

我养过狗的mscs 血清用10%+低糖的DMEM，只要在体外分离细胞的时间操作的快 原代换液的时候操作轻微点 一般24小时首次全量换液 以后每3天换一次 一般在7-9天细胞就能铺满 1：3传代后 头三代细胞张的很快 一般三天都能传一代 一般细胞传到快10代时候细胞透光性就不好了会变薄内有许多脂滴样小泡 说明细胞已经开始老化

sxjcsq2010

我做的也是间充质，细胞近两个月来是特别不好养。这也是很正常的事，另外做样的时候动作要快，否则离体时间过长，得到的细胞会很快老化，进入凋亡状态。

barbieq813

试试加点EGF大概10ml的体积加10~5ul

hzs7918

谢谢各位tx， 我全骨髓分离自认为还是比较快去的，两只老鼠一般是10min杀，取骨，泡入10%的培养基，整个过程一般是30-40分钟。想问问各位大概是什么速度。 种原代细胞的时候一般是一只大鼠种多大的面积？我一般是15cm dish一盘。

liqiulinglql

学习了!我的是脂肪干，也是这样子了。