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作者：王莹 罗速作者单位：北华大学基础医学部，吉林 吉林 132013 " W* W; Y; j$ ?7 C+ J. L/ Q% A
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' j. F. k0 o( q. Y% X; c 【摘要】 目的 建立分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，探讨损伤肝组织匀浆对MSCs的诱导分化作用。方法 采用密度梯度离心、贴壁培养法分离培养大鼠MSCs，以10%损伤肝组织匀浆、10鸖的LDMEM诱导培养，并在不同时间点采用免疫组化方法（SP）检测甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（Alb）的表达。结果 MSCs在含10%损伤肝组织匀浆的10鸖 LDMEM培养基中培养，呈类上皮样细胞。诱导组在培养7 d时，大部分细胞呈AFP阳性表达（75.2%），与对照组比较有显著差异(P＜0.05)； 诱导培养 14、21和28 d AFP 表达阳性率分别为35.2%、12.3%和2.0%，与对照组及不同时间点比较差异显著（P＜0.05）；诱导组在培养7 d仅少数细胞Alb呈阳性表达（14.6%），诱导培养14、21和28 d Alb表达阳性率分别为67.6%、88.9%和95.6%，与对照组及不同时间点比较均差异显著(P＜0.05)。结论 该方法可获得纯度较高MSCs，损伤肝组织匀浆可诱导MSCs表达AFP和Alb。
- ?, [8 Y3 ]* x/ ^$ c# R 【关键词】骨髓；间充质干细胞；甲胎蛋白；白蛋白1 E/ R2 q5 Z4 K9 \! _
间充质干细胞（MSCs）是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，最近许多研究证明，MSCs具有高度可塑性，在特定环境下除可以分化为中胚层组织外，还可跨越胚层界限分化为外胚层以及内胚层的组织细胞。研究发现肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）4等有诱导骨髓MSCs向肝细胞分化的作用〔1～3〕，但对骨髓MSCs的分离培养、体外扩增的影响因素、定向分化的条件等所知甚少。本研究采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间的控制等几方面相结合，纯化大鼠骨髓MSCs，并以损伤肝组织匀浆为诱导剂诱导培养骨髓MSCs，探讨损伤肝组织匀浆对骨髓MSCs的诱导分化作用，为其向肝实质细胞定向分化选择最适微环境。
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, s; G' [( j4 Q% f; x1 ^4 P 1材料与方法; N( Q" s4 u* h; l% d
, |+ N# _; U u/ n' J% O 1.1材料
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. @; q: z. `2 R& O5 P2 G5 W DMEM培养基（Gibco）,胎牛血清（天津血液研究所），胰蛋白酶（Sigma），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）,SD大鼠（长春开发区医学动物实验中心）,兔抗大鼠甲胎蛋白（AFP）单抗、兔抗大鼠白蛋白（Alb）单抗（丹麦DAKO公司）,SP免疫组化试剂盒（迈新公司）。$ F: L/ [- ^* y) @ a6 ]
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1.2大鼠骨髓MSCs的分离纯化、培养扩增. O2 y2 t8 a' r3 e$ T6 A
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选用8日龄SD大鼠乳鼠（体重8～10 g），颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股骨胫骨，冲洗骨髓制成细胞悬液，采用密度梯度离心法分离单个核细胞。接种2106个细胞于10 cm培养皿中，37℃、 5%CO2培养，72 h后第1次换液，约10～14 d细胞接近融合时按1∶4传代，并标记为第一代，至贴壁细胞融合铺满瓶底，重复以上操作，反复传代扩增，并依次标记为第2～9代。
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9 G& ~; }) @0 k. e 1.3大鼠骨髓MSCs表型特点鉴定
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7 ~1 J* L+ |! n3 f 取3代MSCs细胞接种于24孔培养板中（孔中预先放置无菌盖玻片），每孔1104个，37℃、 5%CO2培养，待细胞接近80%融合时，取出盖玻片，PBS冲洗，10%中性甲醛固定15 min，蒸馏水冲洗，3% H2O2/甲醇作用30 min，蒸馏水冲洗，滴加一抗（CD105、CD166）后于37℃孵育1 h，PBS冲洗，滴加生物素二抗，37℃ 30 min后PBS冲洗，滴加SABC，37℃ 30 min后PBS冲洗，DAB显色，以PBS作为一抗阴性对照。
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' j t+ x6 D. w 1.4损伤肝组织匀浆的制备
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6～8 周龄SD健康大鼠10只，体重180～200 g，单笼饲养，禁食12 h。肝大部分切除（全肝体积的78%）24 h后处死大鼠，称取肝组织湿重，按150 mg肝组织/ml LDMEM比例加入无血清培养基，于冰上将肝捣碎，4℃、12 000 r/ min离心20 min，取上清液作为损伤肝组织匀浆。- h2 l, `" y- u4 C
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1.5应用损伤肝组织匀浆诱导MSCs分化
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取3代细胞，调整细胞浓度至（1104·ml-1），接种于3.5 cm培养皿内（2104个，皿内预置无菌盖玻片），37℃ 5% CO2培养，实验组培养基为含10%损伤肝组织匀浆、10鸖的 LDMEM培养基。对照组取同代细胞，常规培养液培养。每3～4 d换液1次，相差显微镜下逐日观察细胞形态。分别于培养0、5、7、14、21及28 d取出细胞爬片，10%中性甲醛固定，干燥后于-20℃保存备检。: I. Y$ k" B' V, ~# {
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1.6SP方法检测MSCs细胞AFP和Alb的表达' r1 b# \" y9 ~ k4 d4 E
* j% y2 P( u: k% t, D( E 具体方法参照说明书，苏木素轻度复染。以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。将染色强度和阳性细胞百分率相结合判断免疫组化染色结果。# j+ r; U4 W* M
{, A& `& U5 l( T 1.7统计学处理
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' W8 y; e! v5 Y$ I) n$ m7 j' m 采用SPSS13.0软件包进行χ2检验。! z$ D9 s C8 L" k2 V
; ^8 z5 t+ c* c- W# O$ | 2结果
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2.1大鼠骨髓MSCs的分离培养
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1 m. t* W7 \1 a 密度梯度离心获得比较均一的球形单个核细胞，培养72 h后首次换液，部分细胞贴壁并分裂增殖，6～9 d后散在贴壁细胞增多，形成多个细胞集落。随着时间延长，集落不断增多、扩大、互相融合，约12～14 d细胞融合成单层，铺满瓶底。传代细胞很快贴壁，增殖迅速，呈梭形均匀分布，传代MSC生长较原代MSCs生长快，约7 d长满瓶底，连续传9代，细胞形态无明显变化，无衰老征象，但9代以后细胞增殖较慢，传代周期延长。骨髓MSCs具有特征性的表面标志，其特点是不表达CD34、CD45，而只表达CD29、CD44、CD105、CD166等基质细胞和MSCs的特异性表面标志，尤其是CD105、CD166已作为骨髓MSCs的特征性标志〔4〕。SP染色阳性结果为胞浆内充满棕黄色颗粒。第3代MSCs细胞的CD105、CD166均为阳性(图1）。
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; { Y( Y2 @8 V! Z% B$ \ 2.2损伤肝组织匀浆诱导大鼠骨髓MSCs分化表达AFP和Alb8 Y6 H9 w1 i5 m
, w3 f( G R; ~* Q 大鼠骨髓MSCs在含10%损伤肝组织匀浆、10鸖的LDMEM培养基中培养，细胞生长状态良好，并呈现明显的形态改变，镜下观察细胞变得稍大而扁平，呈类上皮样细胞；对照组细胞未发生形态学改变，第7天已铺满瓶底，呈成纤维细胞样整齐排列（图2）。SP染色结果显示，对照组细胞无AFP 表达；诱导组在培养7 d时，大部分细胞呈AFP阳性表达（75.2%），与对照组比较差异显著(P＜0.05)； 诱导培养 14、21和28 d AFP 表达阳性率分别为35.2%、12.3%和2.0%，这一结果表明随着培养时间的延长，AFP阳性表达逐渐减弱，差异显著（P＜0.05）；对照组细胞无Alb 表达，诱导组在培养7 d仅少数细胞Alb呈阳性表达（14.6%），诱导培养14、21和28 d Alb表达阳性率分别为67.6%、88.9%和95.6%，与对照组比较差异显著(P＜0.05)，而且随着诱导培养时间的延长Alb 表达逐渐增强（P＜0.05）。% L( J7 e3 q7 u; L1 t
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* j+ `# J0 Z8 u3 \目前骨髓MSCs的分离主要有4种方法：贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。本实验将密度梯度离心与贴壁培养法相结合，用淋巴细胞分离液对骨髓做梯度离心，除去绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞，再根据贴壁性差异，纯化MSCs。结果显示,体外培养骨髓MSCs呈成纤维细胞样的生长特性，1、3及5代细胞的形态、生长曲线无显著差异，连续传代培养9代，细胞形态无明显变化，无衰老征象；传代细胞潜伏期短，增殖迅速，培养时间短；随着传代次数的增加，细胞均质性明显提高，细胞增殖速度无明显下降。SP结果显示，3代细胞均表达CD105和CD166，表达阳性率几乎是百分之百；用含20%马血清的LDMEM培养基诱导培养，MSCs发生形态变化并且胞浆内出现大量脂肪滴，这一结果说明，本实验实现了MSCs向脂肪细胞的定向分化。
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) ]( j+ x$ g6 O3 y骨髓MSCs有多种分化潜能〔5〕，有研究发现，肝大部分切除术后24 h大鼠血清可诱导骨髓细胞向肝细胞分化〔6〕。大鼠2/3肝切除后，施以肝脏强大的再生刺激，合成和分泌大量促进肝细胞增殖的因子，术后24 h，血清HGF和残余肝细胞的DNA合成达到最高峰〔7〕，在细胞分化的特定条件下，多数细胞均有其细胞骨架的特定组分或产生特定代谢的酶，这些蛋白在各细胞中表现出其组织特异性。AFP和Alb均为肝细胞系较为特异的标志，AFP是不成熟肝细胞的标志，Alb是最常用和可靠的一个肝细胞功能的检测标志。Alb主要由肝细胞合成和分泌，其他细胞分泌极少，用SP方法很难检测到〔8〕。本实验结果显示，未经诱导的骨髓MSCs不表达AFP和Alb，经条件培养基诱导培养的骨髓MSCs呈类上皮样细胞，培养7 d时，大部分细胞AFP呈阳性表达，随着培养时间延长AFP表达减弱；培养7 d时，仅少数细胞Alb呈阳性表达，随着时间的延长Alb表达逐渐增强。表明损伤肝组织匀浆能够诱导MSCs定向分化为肝细胞样细胞，损伤肝组织匀浆可以诱导骨髓MSCs分化为肝细胞样细胞，推测可能是损伤肝组织匀浆中某些成分可诱导MSCs分化有，但具体是哪种成分起作用尚待深入研究。1 e6 o0 R" K1 F& X1 I+ {9 F5 V
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发表于 2009-3-3 11:51
发表于 2015-6-11 16:35
