成体脂肪来源的Flk1 间充质干细胞用于杜氏肌营养不良症治疗的可行性研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:17 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：刘艳宁　闫曦　孙昭　韩钦　赵春华作者单位：1中国医学科学院、中国协和医科大学基础医学研究所、组织工程中心，北京 100005；2中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所国家实验血液学重点实验室，天津 300020 $ `1 _( P% v2 f2 Z% |! h* b

   9 O( s) ~; @  e6 L

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      【摘要】  　　为了探讨成体脂肪来源的间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cell，ADMSC）移植治疗杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的可行性，从成年GFP小鼠脂肪组织中分离得到间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)，用流式细胞术分析其细胞表型和细胞周期；在体外分别以成肌和成内皮诱导体系诱导ADMSC的定向分化，通过免疫荧光染色和RTPCR进行鉴定；经尾静脉移植ADMSC到CTX肌肉损伤模型小鼠和mdx小鼠（DMD动物模型）体内，通过RTPCR和免疫荧光染色检测供体细胞的分布和分化情况，并进行统计分析。结果表明：从GFP小鼠脂肪组织中分离得到的Flk1 MSC可以在体外分化为肌肉细胞和血管内皮细胞；细胞移植后，可在损伤肌肉部位检测到GFP阳性的肌纤维、血管内皮细胞和肌肉干细胞；mdx小鼠移植后肌膜上抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达部分恢复，骨骼肌中心核肌纤维比例也大大降低。结论：ADMSC是一种较为理想的供移植治疗DMD的干细胞，它不仅可以定向归巢到损伤的肌肉组织中，参与肌纤维重建，而且能改善组织供血，缓解DMD病征，同时部分供体细胞以干细胞形式存在，可以代替原来肌肉干细胞的功能，不断修复损伤的肌肉组织。 6 Q6 J# O9 p& l. Z. q- w9 X
      【关键词】间充质干细胞；分化；杜氏肌营养不良；干细胞移植5 P' W( i0 `9 R6 `
   　　 Mice Adipose Derived Flk1  Mesenchymal Stem Cells Can Ameliorate Duchenne's Musclular Dystrophy in Mdx Mice for Their Multilineage Potential. S( R# |6 B; ?

LIU YanNing1,2*，YAN Xi1*，SUN Zhao1，HAN Qin1， Robert ZHAO ChunHua1- d' b; a! q$ R

1 Center ofTissue Engineering，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100005，China； 2 State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020，China
4 p) ~) A6 i4 Q3 K6 c* i
AbstractDuchenne muscular dystrophy (DMD) is a common Xlinked disease characterized by widespread muscle damage that invariably leads to paralysis and death. There is currently no therapy for this disease. This study was purposed to investigate the feasibility to use adult adiposederived mesenchymal stem cells (ADMSCs) in the therapy ofDMD. The Flk1  MSCs were isolated from adipose tissue of adult GFP mice; the phenotype and cell cycle of MSCs were analyzed by flow cytometry; the ADMSCs were directionally differentiated by myoblast and endotheliablast induction system in vitro and were identified by immumofluorecence staining and RTPCR; the ADMSCs were transplanted into CTXinjured mice model or mdx mice (DMD animal model) through tail vein; the distribution and differentiation of ADMSCs were detected by immunofluorescence staining and RTPCR respectively, and statistic analysis was performed. The results showed that the Flk1 ADMSCs could beinduced to differentiate into myoblasts and endothelial cells in vitro. After transplanted into CTXinjured mice model or mdx mice,GFPpositive cells could be detected in damaged muscle, and these donorderived cells were also positive for MHC, vWF, or Pax7. Flk1  ADMSC transplantation also partly reconstituted the expression of dystrophin, and reduced the percentage of centronucleated myofibers in mdx mice. It is concluded that Flk1  ADMSCs represent a possible tool for future cell therapy applications in DMD disease, as they can be delivered through the circulation for their potential of muscle homing. And Flk1  ADMSCs also show the ability to contribute to muscle repair, improvement of blood supply and long term reconstitution of dystrophy muscle.
6 A- O9 r  q  ~; u1 [1 K, s' K# j! \
Key wordsMSC；differentiation；DMD；transplantation2 ?; i& Y7 y" v( D7 w3 I

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X性连锁隐性遗传性肌病。由于DMD基因缺陷导致肌细胞膜上该基因编码的抗肌萎缩蛋白（dystrophin，Dys）表达异常或缺失，从而引起肌膜形态和功能损害，致使肌纤维进行性变性坏死。当其肌肉干细胞（muscle satellite cells，肌肉卫星细胞）库的细胞不断调动而耗竭后，肌纤维发生不可逆的坏死，甚至消失，并为增生结缔组织所替代，最终导致死亡［1，2］。目前这种疾病尚缺乏有效的治疗手段，但具有多系分化能力的干细胞移植则为这种先天性疾病的治愈带来了新的希望。在早期研究中用于移植的是成肌细胞（myoblast），它能有效参与宿主多核肌纤维的形成，但因其有较高的免疫源性，因而异体移植难以存活［2］，而胚胎干细胞，肌肉来源的干细胞和边缘群细胞（side population，SP），则存在伦理和取材不易等问题［3-5］。

间充质干细胞（MSC）因其具有三胚层的分化能力，并且具有来源丰富，免疫源性低等特点，可作为一种理想的供异基因移植的细胞［6，7］。以前的研究已经发现，骨髓或脂肪等组织来源的MSC可以在体外经诱导分化为肌肉细胞［8-10］，为这类细胞用于体内移植提供了理论基础，因为脂肪组织较骨髓更容易取材而且来源更为丰富，所以成体脂肪组织来源的干细胞在临床上具有更高的应用价值。在AnneMarie Rodriguez等［11］的研究中发现，成人脂肪组织来源的Flk1阴性的多能干细胞（human multipotent adiposederived stem cell，hMADS）原位移植mdx鼠（DMD模型鼠）后，可在移植部位检测到人特异dystrophin表达。
6 N3 j2 Q1 f3 a3 W; B
在本实验中，我们首先从成体GFP转基因小鼠脂肪组织中分离得到Flk1 MSC，在体外证明其具有成肌和成内皮分化能力，并进一步在CTX肌肉损伤模型小鼠的细胞移植实验中证实Flk1  ADMSC能归巢到损伤部位，参与肌纤维修复，同时采用mdx模型小鼠，发现Flk1  ADMSC移植后，还能分化为血管内皮细胞，肌肉干细胞，并部分重建mdx鼠骨骼肌肌膜上dystrophin的表达，改善其特异性的病理指标。
4 [! S) ]/ ^6 f: x% s
材料和方法* X* X! w. K' q. b
3 J# s1 u3 W6 W& X9 J
动物

7至8周的C57BL/6小鼠购于中国医学科学院动物所。7至8周的mdx（C57BL/10ScSn DMDmdx/J）小鼠和5至6周的GFP小鼠均引自美国Jackson实验室，由南京大学模式动物研究所提供［12］。
9 e! C+ A- h1 ^4 v+ c% c( i
脂肪来源的MSC的分离并培养扩增
4 V) |+ X3 [5 c; k4 U4 W! k2 ^
GFP小鼠断颈处死后，取其腹股沟脂肪垫，以DHank液清洗，剪碎后，以0.075% Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，之后用DHank液洗涤2遍以除去胶原酶。离心收集细胞，细胞按2106/ml 的密度接种于含58%DMEM/F12 、40% MCDB201、2%胎牛血清（FCS）、10 ng/mlEGF、10 ng/mlPDGF、1胰岛素转铁蛋白亚硒酸（insulintransferrinselenium，ITS）、1亚油酸牛血清白蛋白（linoleic acidbovine serum albumin，LABSA）、50 μmol/L β巯基乙醇、2 mmol/L L谷氨酰胺、100 μg/ml 青霉素和100 U/ml 硫酸链霉素的培养液，37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱培养。2天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达70%-80%汇合时，用0.25%胰酶（Gibco公司产品）常规消化，细胞按照1∶3 进行传代。

ADMSC的表型分析' e' V$ B, |5 O; w, C7 a

0.25%胰酶消化细胞，每管细胞2105，以4%多聚甲醛固定后，用含有0.1%叠氮钠和0.5% BSA的PBS洗2遍，加入FITC或PE标记的大鼠抗小鼠直标一抗，4℃孵育45分钟，用PBS洗2遍，用不含BSA的PBS重悬细胞，FACScan (Becton Dickinson公司产品)流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、Flk1和MHCⅡ类分子的表达。对抗体为抗胞内段的，细胞需以0.1%皂素破膜1小时，其余步骤与上述其他免疫表型分析方法相同。

细胞周期测定

1106细胞用80%的冷乙醇4℃固定1小时，用PBS洗2遍，0.5 ml PBS重悬细胞，加终浓度为100 μg/ ml的RNase A，于37℃孵育30分钟。测定前10分钟加终浓度为5 μg/ ml的碘化丙锭（PI）染色, 流式细胞仪FACScan（Becton Dｉｃｋｉｎｓｏｎ公司产品），用汞灯488 nm 波长激发光激发。以ModiFit 软件（Becton Dickinson公司产品）分析细胞周期。

成肌诱导6 R% S: w, W# l1 C: q5 Q

参考Zuk等［10］的方法，2-3代ADMSC按1105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为含DMEM、2% FCS、5%马血清、50μmol/L氢化可的松和100 μg/ml 青霉素及100 U/ml 硫酸链霉素的成肌诱导液培养。该诱导培养液每3天半量换液，诱导培养3周。C2C12细胞系购于中国医学科院学院细胞中心。
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内皮诱导
0 r# B+ u6 p3 g
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience公司产品)包被，按5104个细胞/孔接种ADMSC。内皮诱导液为M199、2% FBS、50 ng/ml VEGF、10 ng/mlbFGF。诱导2-3天。光学显微镜下记录48小时内ADMSC的细胞形态变化过程。6 z1 q* D+ k! M; ~) n

细胞免疫荧光染色* f( K- u' a3 M/ p

成肌诱导4周后，细胞以4%多聚甲醛固定，用PBS清洗后以血清封闭，然后用小鼠抗MHC或vWF一抗(myosin heavy chain，1∶100)室温孵育1小时，PBS清洗后，再以TRITC标记的大鼠抗小鼠IgG二抗室温孵育30分钟。PBS清洗后用Hoechst 33342（Sigma公司产品）复染细胞核。荧光显微镜（Olympus公司中产品）下观察。) e8 N" ~3 c/ o3 g( [5 F

逆转录聚合酶链式反应/ y, B5 |( X- f- n5 o- c4 [0 c$ a. r6 b

培养及诱导的细胞，以TRIzoL 试剂盒（购自Sangon 公司）提取总RNA，总RNA采用Superscript II (Gibco BRL公司产品)试剂盒反转录成cDNA。然后进行半定量RTPCR分析，检测成肌分化特异基因，如Myf5、MyoD、myogenin和myosin的表达，以及内皮特异基因，如CD31、CD34的表达，βactin作为内参衡量上述目的基因的表达量。PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶进行分离，溴化乙锭染色后在紫外凝胶成像系统（KODAK）下分析产物条带。2 e/ t& ]9 b1 h& W- Y% ~7 ^! `
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骨骼肌损伤模型和细胞移植2 s: B8 ?  F. ]8 F0 ]$ c) e
2 z3 v. z2 @+ d3 L
10μmol/L浓度的cardiotoxin (CTX1, Sigma公司产品) 用PBS溶解后单点注射受体鼠胫骨前肌（tibialis anterior，TA），25μl/TA［13］。CTX注射24小时后，5105个ADMSC以25 μl PBS重悬后原位注射到同一TA肌肉，或者1106个ADMSC以200μlPBS重悬后经尾静脉移植。
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组织免疫荧光双染
% M1 ^0 }7 G+ O% A0 K
细胞移植后各时间点取TA肌肉，石蜡包埋后切片，切片脱蜡后以PBS清洗，用大鼠和山羊血清进行封闭，然后分别用小鼠抗MHC、dystrophin、vWF、laminin和Pax7一抗(1∶100)与山羊抗GFP一抗共同进行孵育，室温1小时。这些切片用PBS清洗后，再用TRITC标记的大鼠抗小鼠和FITC标记的兔抗山羊IgG二抗室温孵育30分钟。 PBS清洗后用Hoechst 33342（Sigma公司产品）复染细胞核。荧光显微镜下观察。

统计学分析1 x, U7 T# n' J2 b4 k

用SPSS 10.0 软件进行统计。统计数据用均数±标准差表示，P  U! I5 s  `, Y" w4 z7 o; Q
& B& R) ^+ ^! }7 O4 m
结果

培养ADMSC的形态和表型
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从GFP鼠中分离得到的ADMSC在原代培养中，有两类细胞，一类为成纤维细胞样，分散生长；另一类为内皮细胞样，呈多角形，紧密生长。经过传代，内皮样细胞逐渐减少，传至第2代时，基本消失，视野中都为梭形细胞（图1B）。流式表型分析，ADMSC高表达CD29、CD44、CD105和Flk1，而造血及内皮标志（CD31、CD34和CD45）为阴性, 并且其低表达MHCⅡ类分子（图1A）。细胞周期分析发现, 多数ADMSC都位于 G0/G1期（图1C），其流式表型和周期与骨髓来源的MSC类似［7］。
! Z8 b; M  E# P! e' f+ f! P
Figure 1.Characteristics of ADMSCs.A: phenotypes of ADMSCs. B: cell morphology of ADMSCs at the 3th passage (200). C: cell cycle of ADMSCs.
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Flk1 ADMSC在体外经诱导可分化为肌管细胞) w9 u# L3 V$ Z- O* t1 i
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Flk1 ADMSC用成肌诱导体系诱导培养1周后，部分细胞体积明显增粗，由原来的梭形变为胖杆妆（图2A），诱导2周后，个别细胞开始彼此融合，逐渐形成多核肌管样细胞。诱导3周时，MHC免疫荧光染色显示，部分细胞呈阳性（图2B，C）。半定量RTPCR分析显示，Flk1 ADMSC在成肌诱导过程中渐次表达成肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)家族中Myf5，MyoD，myogenin和myosin等基因［14］（图2D）。

　MSC在体外经诱导可分化为血管内皮细胞+ R, O% P: c3 `  g
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在成内皮诱导最初的12小时内，接种的细胞由圆形逐渐伸展成短梭形，由分散状态逐渐变成一些聚集的细胞群（图2E）；第24小时，细胞簇变大，簇与簇之间连接，能够看到初步的网格状形成；48小时后，网格之间连线变细，由节点互相连接，形成网格样结构（图2F）。vWF免疫荧光染色显示，多数细胞呈阳性（图2G）。RTPCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31和CD34（图2H）。

Flk1 ADMSC可归巢到损伤肌肉并参与其修复
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C57BL/6小鼠单腿以CTX致损24小时后，尾静脉移植GFP小鼠来源的Flk1  ADMSC，分别于移植后24小时、7天和4周时取CTX损伤胫骨前肌（TA）和对照TA肌进行分析。 RTPCR分析显示，CTX损伤的TA于24小时起即可检测到GFP表达，而未损伤的对照TA至1个月仍未见GFP表达（图3A）。移植后4周，MHC免疫荧光双染，可见GFP/MHC双阳性的供体来源的肌纤维（图4A）。同时，我们还检测了其它组织中供体细胞的植入情况，仅在肺脏中检测到少量GFP阳性细胞（图3B），但这些细胞并不表达MHC。由此可见，Flk1  ADMSC倾向于归巢至损伤肌肉部位，并且其成肌分化具有组织特异性。" {8 ~! c0 |; q1 z- @

Flk1 ADMSC可在宿主内分化为血管内皮细胞$ G+ H& O3 R* H) J- I8 {

mdx鼠细胞移植后4周，可在血管样结构部位检测到一些GFP阳性细胞。为了进一步证实这些供体来源细胞的特性，用血管内皮细胞特异的vWF抗体进行免疫荧光双染，可见GFP/vWF双阳性的供体来源的血管内皮细胞（图4B）。Flk1  ADMSC的成血管分化能力将有助于改善新生肌肉组织的供血情况。

Flk1 ADMSC可部分重建mdx鼠中dystrophin的表达并改善其病理特征

为了进一步探讨Flk1  ADMSCs移植是否能纠正mdx鼠肌肉功能蛋白的表达缺陷，我们在移植后4周取TA肌肉进行dystrophin染色，发现其边缘核特征的dystrophin阳性的成熟肌纤维成簇存在，并且几乎所有这些肌纤维都是GFP阳性的（图5A）。在移植后3月仍可检测到许多GFP/dystrophin双阳性的肌纤维。

骨骼肌中以新生中心核肌纤维为主是DMD一个明显的病理特征，我们分别在移植后各时间点取mdx实验组和对照组的TA肌肉，统计中心核肌纤维比例，发现这两组的中心核比例在移植后2周没有明显差异，而在移植后4周和3个月时，实验组的中心核比例要显著低于对照组（P
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移植后部分Flk1 ADMSC以干细胞形式存在
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植入的细胞能否补充mdx鼠肌肉的卫星细胞库将关系到细胞移植的长效性。在细胞移植后4周，我们取mdx鼠的TA肌肉进行检测，发现一些GFP阳性的供体来源单核细胞表达Pax7［15］（图6A），它是肌肉卫星细胞的一个特异性标志，并且这些单核细胞位于肌纤维膜和laminin阳性的基膜之间（图6B），正好也与肌肉卫星细胞的特异组织定位相符［16］。

　讨论- U5 c1 o5 {3 D/ i4 I" R( x

DMD作为一种性连锁的致死性肌病［1］，传统的药物治疗无法从根本上纠正其基因表达缺陷，而基因治疗尚存在一系列困难［17］，干细胞因其具有多系分化潜能，移植后可补充功能蛋白的表达缺陷，从而给患者的治愈带来新的希望。干细胞用于临床治疗主要考虑这几项因素：①是否有伦理上的限制；②细胞量能否满足临床需要；③移植细胞的免疫排斥问题；④移植后细胞植入是否具有组织特异性；⑤由于一般的组织损伤都非单一细胞受损，移植的细胞是否具有多系分化的能力；⑥细胞移植的疗效；⑦植入细胞是否能以干细胞形式存在，长期发挥作用。成体脂肪来源的间充质干细胞不存在伦理问题，取材方便，来源丰富，容易扩增，免疫源性低，而且已经有多个实验室报道其具有多系分化能力，所以它是一种理想的供移植用的细胞。但是这种细胞植入是否具有靶向性？植入宿主体内后是否真的具有治疗效果呢？细胞移植是否具有长效性呢？
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在实验中，我们从成体GFP小鼠的脂肪组织中分离出间充质干细胞样细胞，发现其流式表型与骨髓来源的MSC类似。而BMSC已被多个研究小组证实，能在体内外环境中分化为肌肉细胞并参与肌肉损伤的修复过程［18，19］。我们发现，在体外诱导环境下，Flk1  ADMSC具有成肌和成血管内皮分化能力。在体内实验中，我们选择CTX肌肉损伤模型和mdx小鼠，以检验Flk1  ADMSC是否能定向归巢、参与宿主肌肉损伤的修复，并减轻DMD的症状。我们利用CTX损伤的C57小鼠模型，尾静脉移植GFP小鼠来源的Flk1  ADMSC，发现GFP阳性的供体细胞可以归巢到CTX损伤侧的肌肉中，并参与肌纤维的重建，而在未损伤侧的肌肉则没有分布［20］，另外在肺脏中也检测到少量供体细胞存在，这可能是肺静脉的正常截留，但是肺里的供体细胞并不表达肌纤维标志（MHC），这说明Flk1 ADMSC在受体内的植入及分化具有组织和损伤环境特异性。但mdx小鼠尾静脉移植Flk1 ADMSC后，未经CTX损伤的TA肌肉中也检测到供体细胞的存在（数据没有显示），这可能是因为mdx鼠的肌肉本身就处于不断坏死和重建的循环过程，存在炎症环境，这就为Flk1 ADMSC的植入创造了条件。Torrente等［21］报道，mdx小鼠的血管内皮表达MAdCAM1，该分子可能介导供体细胞向炎症部位的归巢。Flk1 ADMSC向损伤肌肉组织的归巢能力就使得DMD的细胞治疗中，静脉输注可作为一种操作性更强，更为有效的移植手段。# C  ?6 k1 ]% D. ]  ]/ c

本实验中，Flk1 ADMSC植入mdx鼠后，除参与宿主肌纤维的修复外，还有部分供体细胞分化为vWF阳性的血管内皮细胞。许多证据表明，Flk1是一个重要的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）标志［22，23］，且在本实验室以前的研究中已经证实，Flk1阳性的脂肪组织来源的成体干细胞在移植到下肢缺血动物模型体内时，可在缺血部位分化成内皮细胞，从而为新生肌肉组织提供了充足的血液供给［24］。体外Flk1 ADMSC的成内皮诱导需要VEGF和bFGF等细胞因子作用，而在体内，有可能是营养不良肌肉所释放的环境刺激因子触发了其内皮分化，进而改善组织供血，改善局部微环境。4 O$ K& b4 z; R' [2 h' N

细胞移植后能否减轻DMD症状是评价干细胞治疗有效性的最主要标准。肌细胞膜上dystrophin的缺乏或结构变异，是DMD患者最主要的分子病理学特征，其缺陷会引起肌细胞膜形态结构异常，肌膜通透性及转运功能改变，致使肌细胞遭受破坏，为脂肪组织及纤维化组织所替代，所以如何纠正dystrophin在肌膜上的表达缺陷是根治本病的关键。本实验中Flk1 ADMSC植入后能部分重建mdx小鼠骨骼肌中功能性蛋白dystrophin的表达，并且这些dystrophin阳性的肌纤维具有成熟肌纤维的特征——具边缘核。骨骼肌以新生（非成熟）中心核肌纤维为主是DMD的一个明显的组织病理学特点，Flk1 ADMSCs植入后可显著减少mdx小鼠骨骼肌中中心核肌纤维的比例，这些数据都表明Flk1 ADMSC植入后能发挥治疗作用，有效改善DMD的特异病理指标。. Z/ F$ N$ {! \8 J+ F& ?

DMD患者的另一重要特征是其肌肉干细胞库随年龄增长而耗竭，从而导致了肌肉组织不可逆的变性坏死。它能否用肌肉的卫星细胞库来补充就成为干细胞治疗是否具有长期功效的一个重要指标。之前已有人报道，肌肉和骨髓来源的成体干细胞移植mdx小鼠后，可在宿主肌肉中检测到供体来源的肌肉干细胞［19］。我们的研究中发现，Flk1  ADMSC移植后，一部分植入的供体细胞也以肌肉干细胞的形式存在于mdx小鼠的骨骼肌中。这些GFP阳性的外源细胞表达肌肉卫星细胞特异性的表面标志Pax7［15］，并且位于肌细胞膜与基膜之间，既通常认为的肌肉卫星细胞的特异组织定位［16］。这预示着，DMD患者进行Flk1  ADMSCs移植后，部分供体细胞将以肌肉干细胞形式存在于患者体内，并能在后继的肌肉损伤中继续发挥作用。9 P! {& R; Y: P* o/ b, g
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由此我们认为，Flk1  ADMSC是DMD的细胞治疗中一种理想的供体细胞，它不仅可以定向归巢到损伤的肌肉组织中，而且可以参与肌纤维修复，部分纠正功能蛋白dystrophin的表达缺陷，同时部分供体细胞还以肌肉干细胞形式存在，可以补偿或代替宿主肌肉卫星细胞行使功能，不断修复进行性损伤的肌肉组织。& H) j0 s+ N  K; c
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