对目前iPS细胞相关专利的深入分析 （转）

平步

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对飞速发展的iPS研究领域里三项专利的深入研究有助于我们判断其最终价值。
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　　2007年，诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)的出现轰动了整个科学界。iPS细胞的出现给干细胞研究带来了一种新的手段，我们可以不再受到以往研究过程中使用到的人体胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES)的种种相关问题的限制了。人体胚胎干细胞来源于两天大小的人体胚胎，而且还需要借助克隆技术才能获得可用于临床治疗的与患者遗传背景相匹配的细胞系，相比之下iPS细胞技术就方便多了。首先从来源方面来看，iPS细胞就具有很大的优势，因为它是来源于个体体细胞而不是人体胚胎。iPS细胞的出现让我们得以将各种已分化细胞，不论是患病细胞还是其它细胞都能够对其进行重编程，使其回复到胚胎干细胞状态，从而获得与供体遗传背景完全匹配的永生细胞系。
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　　自从iPS细胞诞生以来，该领域就以惊人的速度飞快发展着，从国际上相关专利的申请情况就可见一斑。在本文撰写的时候，国际上的iPS细胞相关专利已经达到了数十项，在过去的两年里，第一批三项专利分别在日本、美国和英国获得批准(表1和表2)。接下来，我们将通过每项专利申请保护的内容对这三项专利进行详细介绍。9 Q% y  G) x! b6 l. i7 y

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: x$ [3 N) Q/ l4 H! c6 D已获批准的专利简介% b# `  t! x: q6 H
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　　第一个获得批准的iPS细胞相关专利是日本在2008年9月12号颁发给Shinya Yamanaka的。Shinya Yamanaka是在2006年12月12日提交的相关资料，优先权日期(priority date)是2005年12月13日。快速审批专利(fast-tracked patent)涵盖的内容包括将重编程因子Oct 3/4、Klf4、c-Myc和Sox2转入体细胞，使其重编程为iPS细胞的方法。这种干细胞制备方法之前已经在日本和其它好几个国家都递交过专利申请文件了。" L+ j+ g8 i, Y+ m' P( I4 F
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　　第二项iPS细胞相关专利是在2010年1月12日被英国政府授予Kazuhiro Sakurada的。Kazuhiro Sakurada他们是在2008年6月13号提交的申请文件，优先权日期是2007年6月15日。Sakurada他们的专利内容是在人体组织细胞中表达Oct3/4、Sox2 和Klf4等因子(没有包括c-Myc因子，不过是在有FGF-2因子存在的条件下进行培养)使其重编程为iPS细胞。按照Sakurada等人的方法获得的这些iPS细胞能够自我增殖，也能分化成外胚层来源细胞(ectoderm)、中胚层来源细胞(mesoderm)和内胚层来源细胞(endoderm)。Sakurada他们去掉了c-Myc因子，对于治疗应用来说这是一项重大的技术进步，因为c-Myc因子是一个潜在的致癌因子。4 v4 B0 u. w8 [: _

2 S9 u& i# j+ y  ^　　Yamanaka和Sakurada的方法中都使用到了Oct3/4、Sox2 和Klf4这三个因子，尽管从这一点上来说他们好像没有什么区别，但是实际上他们各自的专利内容还是各不相同的。其中最大的区别就是Sakurada的方法中没有用到c-Myc因子。Yamanaka和Sakurada还签署了交换专利权(cross-licensed)协议，禁止他人未经授权就使用他们两种方法中的任何一种。不过Yamanaka和Sakurada的专利目前都属于最近由美国波士顿的Pierian公司和位于美国旧金山生物科技湾区(San Francisco Bay Area biotech)的iZumi Bio公司合并而成的iPierian公司。3 z" u! [) ]9 C" d
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　　不过最近有消息表明有一项专利是在Sakurada的专利和 Yamanaka的专利获批以前就已经得到批准了，这个消息一出就彻底改变了有关iPS细胞知识产权问题的格局。这项专利是由Rudolf Jaenisch提交的申请，于2010年3月23日被公开。Jaenisch的这项专利也被称为828专利，最早是在2004年11月24日提交的申请，优先权日期可以追溯到2003年11月26日。这项专利涵盖的范围非常广，包括将携带有内源性多潜能基因的体细胞与编码某个选择性标记物(比如与该内源性基因表达情况相匹配的分子或者在细胞内表达的外源性核酸分子编码的与某段调控序列相关联的多潜能蛋白等等)的DNA相联系的技术。这种内源性基因是只在多向分化潜能胚胎干细胞(pluripotent ES cell)里表达的一种基因，它对于胚胎干细胞的多向分化能力至关重要。随着胚胎干细胞的分化程度逐渐升高，这种基因的表达水平会逐渐降低。相应的多向分化蛋白(pluripotency protein)也是一种在多向分化潜能胚胎干细胞里表达的一种蛋白质，随着胚胎干细胞的分化程度逐渐升高，这种蛋白质的表达水平会逐渐降低。
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) b. V6 |9 k# ]5 P9 ~　　828专利还有一项独立申明，表明他们介绍了一个体细胞系，不过第一次明确提到该细胞系是需要内源性基因Oct4基因或Nanog基因的多向分化潜能作用的，该申明还提到在该细胞系中外源性表达Oct4基因、Nanog基因或Sox2基因也能起到重编程的作用，并且将这些基因与某调控序列相对应。该专利还对这种细胞系本身进行了保护，还对内源性Oct4基因或Nanog基因重编程体细胞的潜力进行了介绍。
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/ P7 O- _, x0 k% f　　接下来，我们就将对这个在美国获得的第一个与iPS细胞相关的专利进行详细的介绍。
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; w$ W  W% b7 k　　Jaenisch的专利申请有足够的支持证据吗?1 X4 N. i7 C) g/ Y, e2 v

# Q9 A1 U' M7 |　　828专利保护的范围可能还是受到了因为当时没有完全公开专利技术所造成的一些限制。这些公开的程度直接影响到了该专利的优先权日期最早能够追溯到什么时候，Jaenisch的专利必须要对他们的技术进行详细的阐述，并且能够证明他们是在2003年就已经发明了该技术的。! j! p) Y4 H0 t. C+ w& H. Y9 d

" D! r9 `- J; c0 J0 D　　要判断这些专利到底保护了哪些发明，首先就应该在第一时间在申报材料中对这些发明进行详细的介绍，同时对它们提出专利保护申请，而且这些材料还需要满足相应的条件。而要满足上述这些要求我们首先就需要判断Jaenisch提出的这些申请材料是否能够证明Jaenisch是这些技术的发明人。要批准该专利申请我们还需要进行周密的考虑，看看这项早在2003年就提交的专利申请在专利保护期之内，会在多大的程度上与一项在干细胞研究领域里常用的技术发生冲突。
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　　美国联邦巡回上诉法院(US Court of Appeals for the Federal Circuit)最近对著名的阿瑞雅德(Ariad)制药公司与礼来(Lilly)制药公司(Ariad v. Lilly)之间的专利侵权案件进行了重审，美国联邦巡回上诉法院认为阿瑞雅德(Ariad)制药公司在专利申请文件中对专利申请内容的介绍不符合规范，因此驳回了原判(背景介绍：2006年3月，礼来制药公司因为其抑制NF-κB信号通路的新药Evista和Xigris在美国马萨诸塞州地区法院被起诉侵犯了美国阿瑞雅德制药公司持有的6410516号专利，法院判决礼来公司需要向阿瑞雅德制药公司一次性支付6500万美元的专利侵权使用费，而且在以后还需要继续将销售额的2.3%支付给阿瑞雅德制药公司。不过由于NF-κB信号通路是人体细胞内非常重要的一条信号通路，它可以对300多个基因发挥调控作用，与多种人体疾病都相关，而且目前市面上用于抑制NF-κB信号通路的药物已经多达200多个，因此此案出现了争议。)。美国联邦巡回上诉法院认为阿瑞雅德制药公司对NF-κB信号通路这样一种牵涉广泛的转录调控途径申请专利保护是无效的，他们不能够因为自己发明了某种抑制NF-κB信号通路的药物就独家垄断NF-κB信号通路这个宝贵的财富。而且美国联邦巡回上诉法院还发现阿瑞雅德制药公司并没有对他们发明的能够抑制NF-κB信号通路的药物进行详细的介绍。
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　　随后，美国联邦巡回上诉法院颁布了一个指导意见，帮助判断专利是否符合美国国家法规35编112条第一段的规定，即发明专利的书面描述独立于可操作性描述(美国国家法规35编112条第一段规定：专利说明书必须包含对发明的书面描述，并以全面、清晰、简洁和精确的专业术语描述其制作过程和使用方式，已确保所属领域或相近领域的任何人员能够制造并使用此项发明)。在再审过程中，美国联邦巡回上诉法院认为在判断某项专利是否符合可实施性(enablement requirements)要求时有以下几点需要注意：; k1 i1 J( V8 m! k  V
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　　1. 必须要开展的实验的数量(the quantity of experimentation necessary)" L! P+ G8 T8 j$ z6 I

* c+ x  U2 t% p' e" T　　2. 在申请文件中提交的实验方法的数量(the amount of direction or guidance presented)
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　　3. 是否有工作样品(the presence or absence of working examples)
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8 h- {+ N  D7 A" k' o5 q+ E( x　　4. 发明的本质(the nature of the invention)) d( F  _  j3 o/ y
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　　5. 现有相关技术的水平(the state of the prior art)5 u6 K5 L6 A6 c% P2 Y
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　　6. 该专利涉及的相关技术(the relative skill of those in the art)9 ~( z3 V1 J9 o- z
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　　7. 该专利的可预测性或不可预测性(the predictability or unpredictability of the art), v  P( ]; C! U  Q- g) E

3 m6 W+ j+ v. j' t4 C6 U5 l　　8. 专利申请所设计的范围(the breadth of the claims)7 Z, c6 X% J: K4 ^* }3 T
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　　法院如果根据上面这几条来审核一项专利就可以判断出该申请是否提交了足够的支持材料了。接下来，我们将根据以上这几点以Jaenisch的专利申请为例进行展开讨论。
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( {: F  e. Q' d　　究竟涉及了哪些体细胞?
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! }: S" Q+ G# }  N: M! f2 _/ n( m' i　　828专利里涵盖的体细胞是所有含有多向分化潜能基因的体细胞，包括哺乳动物细胞。为了能够获得专利保护，Jaenisch需要证明早在2003年他们就已经能够利用体细胞(包括哺乳动物体细胞)制备出一个可诱导多潜能干细胞了，而且其他人根据他们的实验方法也能得到相同的结果。$ O/ `- k; B  b5 T
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　　Jaenisch等人使用的是鼠源细胞，因此应该也能扩展到其它哺乳动物细胞，包括人体细胞。这种情况就和另一起礼来公司和UC Regents之间的诉讼官司(这场诉讼还要早于阿瑞雅德制药公司和礼来制药公司的那场诉讼)的情况比较相像，当时美国联邦巡回上诉法院认定仅仅依靠大鼠胰岛素编码cDNA的相关证据并不能对所有的脊椎动物胰岛素编码cDNA和哺乳动物胰岛素编码cDNA提出专利保护申请。这种限定原则是根据遗传密码的简并性而制定的。而如果要判定828专利是否对所涉及的哺乳动物细胞进行了足够的描述，法院可能就需要一名具有普通技术的相关领域从业人员的帮助，看看他是否能够根据专利申请里的描述找出问题。如果在哺乳动物细胞中还有更多的不可预知的细胞成员，那么就应该在专利申请中进行尽可能详细地列举。0 T  u0 j8 l( S( \1 J! G- C

: x5 ?  r9 U; r4 N  I2 D# g　　828专利有一个突出的特点，那就是它的优先权日期非常早，是在2003年11月26日。直到四年之后的2007年才有两个研究小组各自独立报道了他们成功利用人体成纤维细胞而不是胚胎细胞制备出了iPS细胞。从这个角度来看828专利要比Yamanaka 的专利和Sakurada的专利早得多。在专利申请提交日期上的巨大差异也让大家产生了疑问，当时的干细胞研究水平究竟到达了一个什么样的程度呢?尤其在考虑是否满足Jaenisch的要求，对所有的哺乳动物细胞都进行专利保护时这个问题显得更加突出。实际上根据Jaenisch的申请文件，他的技术只用于鼠源性细胞，其他人无法将他的技术推广到其它哺乳动物细胞，因此不足以支持他的申请要求。
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! l) v1 V6 p) y/ s" X　　不过随后不久，我们就成功获得了利用人体体细胞重编程产生的iPS细胞，这也许能够说明从鼠源细胞到人源细胞的技术跨越其实并不是不可预测的。Yamanaka最早在2006年的文献中报道了他们的鼠源iPS细胞系，随后不久，他们就在2007年成功获得了利用人成纤维细胞重编程而得的iPS细胞。不过人体胚胎干细胞系的研究情况就与这种飞速的种属跨越情况完全不同，James Thomson最早于1995年获得了人体胚胎干细胞，他也就此申请了专利。但是早在1982年，就有人第一次在《自然》(Nature)杂志上报道了小鼠的胚胎干细胞提取方法。2008年，Thomson的专利通过了复审。复审委员会认定Thomson的专利具有非显而易见性(nonobvious，即专利发明人能够展现出比一般技术人员更多的灵感与技巧，不是随随便便就能想到的。如果每一个微小的进步，排除那些超出一般技艺水平的发明，都要给小部分的发明人以专利权的垄断权利，显然，这是不公平的，其后果是有害的)，认为按照当时的情况，用于分离小鼠胚胎干细胞的技术并不一定能够推广到其它的物种，尤其是推广到人类实验当中。换句话来说，在当时，Thomson不可能根据现有的小鼠胚胎干细胞分离技术发明出他的人体胚胎干细胞制备技术。但是在2003年缺乏与iPS细胞相关的文献的情况下是否也能对Jaenisch做出以上的推断，认为828专利也具有非显而易见性呢?我们不知道828专利能否支持对含有多向分化潜能基因的人体细胞申请专利保护。最近，美国专利复审委员会(Board of Patent Appeals and Interferences)修改了他们对Thomson专利复审决定中的一项内容，因为该委员会发现，很明显可以利用分离小鼠胚胎干细胞的方法来分离人体胚胎干细胞。
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1 E) e) H# f/ ?4 E　　究竟涉及了哪些多向分化潜能基因?
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/ t  g- a3 T6 ^　　因为828专利涉及到的仅仅是那些需要导入外源基因的体细胞，因此应该不包括直接导入蛋白的方式。不过Jaenisch还至少提出了两项后续申请，并且要求这些后续申请的优先权日期同样是2003年11月。Jaenisch在他的专利以及其后续申请中都提到了各种重编程因子，包括染色质重构因子(chromatin remodeling agent);Nanog、Oct4以及Stella等基因编码的多向分化潜能蛋白(pluripotency proteins);以及对维持细胞多向分化能力至关重要的基因，例如Sox2、 FoxD3、 LIF、 Stat3、 BMP、 PD098059等基因。虽然这些后续申请当中提及的重编程技术或因子目前还没有得到广泛的应用，但是Jaenisch可能会要求对这些重编程因子及技术授予专利权，因为他在有关828专利的诉讼当中曾经被要求挑选出一些专利声明。+ Q- Z. s6 |3 g% o! Y

3 C: h' r9 E* m　　在最近授予的专利当中，Jaenisch那份涉及面最为广泛的独立请求书(independent claim)以及据此提出的其它请求可能都会遭遇到挑战，因为它们都没有明确指出什么才是重编程过程必需的多向分化潜能基因。在没有出现重编程技术的时候，仅仅提到几种可能有效的多向分化潜能基因是不足以满足申请一项专利时所要求的详细介绍要求和可实施性要求的。同时，正如Yamanaka的工作所表明的那样，要发现一套能够起到重编程作用的正确的转录因子组合方案也不是一件容易的事情，要知道Yamanaka为了得到这样一套组合方案，对24种转录因子进行了各种组合实验。不过Jaenisch在两项独立请求书里却明确提到了Oct4、Sox2 和 Nanog这三种多向分化潜能基因具有重编程细胞的能力，不过重编程的效率不是很高。不过目前看来，Jaenisch提到的Oct4和Sox2这两种基因的确是必需的细胞重编程因子。
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6 d8 _, A% X6 [! U7 }　　因此，如果要在美国开展与Yamanaka 和Sakurada的专利相应的操作，就可以从828专利当中找到支持依据。法院可能会认为一个具有普通生物化学知识的人也会用到这些基因，而且可以从少数几种被选方案中准确挑出这些会取得成功的方案。由于Jaenisch的专利申请时间最早，因此他的优先权日期也相应的要早一些，这对他来说是一大优势。
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2 n) l! C2 j7 p1 L& p　　利用蛋白来进行重编程操作
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( Q2 V/ p# f* Z% N8 u  u　　828专利的公开是否会彻底封闭后续利用蛋白质进行重编程操作来申请专利的可能性呢?虽然目前还没有人获得类似的专利，但是已经有人在专利的说明文件里提到了染色质重构因子和由Nanog、Oct4 以及Stella等基因编码的多向分化潜能蛋白。问题在与公布了828专利之后，是否能够让人很容易地想到利用多向分化潜能蛋白来进行重编程操作。是否一名普通的生物化学技术人员都能成功地实现这一想法，是否只有少数几种可预见性的解决方案。不过这些问题的答案看起来似乎都是否定的，因为在当年提出专利申请的时候还很难表达纯化出这些多向分化潜能蛋白，哪怕是在六年之后的今天也不是一件非常容易办到的事情。由于这些实际困难以及缺乏证据的实际情况，828专利很难提供足够的信息证明在2003年可以利用多向分化潜能蛋白完成重编程操作，虽然他们在申请文件当中提到了这些可能性。最后需要提及的是，Jaenisch专利中使用到的技术还需要依靠可选择的载体介导的基因或核酸传递系统，但是这种技术手段因为iPS细胞的治疗需要已经被淘汰了。
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　　结论( X1 v# R( V; ^) ~* Y( z
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　　如果存在一些在828专利的后续申请当中没有提到的新的重编程方法，那么828专利的影响范围还是非常窄的，尤其是目前研究方向已经从利用多向分化潜能基因转变为利用蛋白质进行重编程操作之后。自从828专利被公开之后，蛋白质重编程技术已经发展了好几年了，这也从一个侧面说明该技术并不是可预见性的。
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5 u' a. V0 L) }* _8 m- G0 w, W6 E( U　　总而言之，828专利告诉我们了我们以下几点：2 a- i! j$ G5 D1 y7 w: y
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　　1. 可以利用Oct4基因和Sox2基因这两个多向分化潜能基因对细胞进行重编程操作) f9 j5 |- Q# O5 P" P

7 Q6 [; G3 k6 ?　　2. 不能利用这些基因对所有的体细胞，包括哺乳动物细胞提出专利保护申请
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　　3. 不能据此就排斥了利用多向分化潜能蛋白或染色质重构因子等方法重编程细胞技术申请专利保护的可能性。
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　　虽然这些决定最终都会经由法院或者美国专利与商标署(US Patent and Trademark Office)对专利进行复审时慎重作出，因此我们的推测也都不是最后肯定性的结论，但是我们的分析表明，828专利并不会像某些人担心的那样(也不会像Jaenisch创办的Fate Therapeutics公司炫耀的那样)会造成广泛的影响。不过即使828专利并不能造成这么大的影响，它还是有其自身的价值的。正如H1细胞系和H9细胞系已经成为了标准的人体胚胎干细胞系一样，使用828专利提到的重编程因子进行重编程操作获得的细胞系也会带来类似的争议。这些细胞系极有可能成为一种新的实验参照细胞系，如果它们被广泛使用了，那么828专利就会表现出它的价值。3 M9 \0 Y$ W& O' R2 k

) D) ^, n: `6 }& K2 s- p+ Q0 ?　　原文检索：
1 x! u7 Y6 v  d3 Z% J3 Y
3 e" |; ~8 L, T  s3 S( u　　Brenda M Simon, Charles E Murdoch & Christopher T Scott. (2010) Pluripotent patents make prime time: an analysis of the emerging landscape. Nature Biotechnology, 28: 557-559.
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8 C5 |/ ?9 T8 }3 B! T3 O% \, l; Z　　筱玥/编译
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% t6 n& s- J. I; n　　注：本文仅代表原作者个人意见，不代表本刊立场!

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