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作者：李健宁，孙欣，林颢作者单位：广东医学院附属医院骨科， 广东 湛江 524001 9 |4 N _& O' s$ G. W0 v
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/ R7 b+ q ]1 F! P: `: ~2 T! ~' N: Z 【摘要】 ［目的］观察扇贝多肽(polypeptides from chlamys farreri，PCF)对人脐血干细胞(human umbilical cord blood cells，HUCBCs)中的酪氨酸蛋白酶(PTKs)活性的影响。［方法］取新鲜人脐血干细胞原代培养，贴壁2 d后，分别用1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀释的扇贝多肽液37℃继续培养，至第24、48、72、96 h收集细胞，进行形态学观察；以神经营养因子(NGF)作为阳性对照；以DMEM作阴性对照。使用［1y-32p］ATP掺入，液闪计数法测定酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性。［结果］阴性对照组HUCBCs的PTK无活性，阳性对照组PTK活性升高。PCF组48 h PTK活性升高(P; N! @) r% `7 A7 k3 `
【关键词】人脐血干细胞； 贝多肽； PTKs' T/ b2 c% d8 K* N! f$ M$ }$ |5 p
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; }' Q: L2 R' z' m/ w; m7 Q2 W 近年来，人脐血干细胞(human umbilical cord blood cells，HUCBCs)应用于脊髓损伤的细胞移植研究较多［1］。在自然条件下HUCBCs自身的再生能力弱，然而在某些因子的刺激下其生长可明显加快［2］。酪氨酸蛋白激酶(PTKs)广泛存在于各种细胞内［3］，是细胞分化信号传导途径的一种关键性物质，来源于细胞外的信号通过该酶将信息传入细胞核内，并启动细胞向成熟方向分化［4］。本文观察了中药扇贝多肽(polypeptides from chlamys farreri，PCF)对体外培养的HUCBCs PTKs活性的影响。9 A1 R+ w9 R+ S) c& H& l5 |' }
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1材料与方法3 k3 [* ?/ l/ A& X
( g a7 _4 J% w; V0 L9 u* I* o, d 1.1制备脐血单个核细胞(mononuclear cell，MNC)悬液,参照Ha等人［1］方法采集脐血单个核细胞，以1106／ml的细胞密度接种于含DMEM／F１２10 ml的培养皿中原代培养，贴壁2 d后将更换含不同药物的培养液。
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g) Z" X/ {( l- p4 L 1.2PCF液对HUCBCs生长的影响 i# V }- P( I
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PCF液(中国水产科学院黄海水产研究所提供，生药含量2 g／ml)按1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀释；NGF(第二军医大学生物制品检测中心研制，批号：960510，5 000 μ／支)按1∶15000稀释，作为阳性对照，DMEM作阴性对照。原代培养HUCBCs贴壁2 d后，将37℃培养，平行样3个。分别于培养后第24、28、72、96 h收集细胞，进行形态学观察和PTK测定。
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: M; `8 \0 I2 @7 s% W0 }* C 1.3PTKs活性检测
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2 G$ F1 v# i. A, D6 l3 B" v 使用［1y-32p］ATP掺入，液闪计数法观察各组HUCBCs PTK活性的变化。PTK测试系统(美国Gibco公司产品，NO：13154-018)。按试剂系统推荐配方配制抽提液。按试剂盒说明，取1 mm培养后的HUCBCs进行鉴定。Wallac液体闪烁计数器(芬兰)计数，每样计数1 min，计算激酶活性。
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1.4统计学处理, C' {5 I$ ~) W" C }' h. B
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不同浓度及不同时间的样品结果用多样本比较的秩和检验进行统计学处理。& k% t& J" ]' u9 [. ]
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2结果6 p! V4 e2 c' H4 {6 H% C, r
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1 r* N: j! n' m) I0 _% a# e PCF、NGF组培养24 h时，大部分细胞已经贴壁，呈球形；各组细胞形态观察：PCF组和NGF组，在Olympus倒置相差显微镜观察24 h时，培养大部分细胞已经贴壁，呈梭形，48 h后大部分细胞体呈三角形或多角形，细胞发出纤细突起。HUCBCs中PTK活性测定结果(表1)。* r+ k( `: ~& p8 E7 \
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4 n. \7 r- {& J9 R0 }) S 表1人脐血干细胞中PTKs活性测定结果（略）' A7 r' g, V0 s9 y+ v" o
+ B# E6 t0 [1 B' B3 |4 K5 h+ ~ 组间比较，P
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3讨论9 k+ w2 h7 V' u3 a+ S
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# M% a7 t# u: h ]. m 海洋特殊环境赋予海洋多糖结构的特殊性和功能特异性。PCF是从扇贝中提取纯化的含有4种组分的化合物，参与各重大生命过程，在胚胎生长发育，细胞生长分化、发育和分化起着重要作用［5］。研究发现PCF能清除体内氧自由基、扩张血管和提高免疫功能，特别是抑制神经细胞的凋亡［6］。) I7 T2 I3 j& z, `& ~
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. t" G2 v' J d HUCBCs是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。无论在免疫治疗方面还是在移植治疗方面，以及细胞周期的研究方面都具有重要的使用价值。5 z, a7 N( \) e, L) P* B
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/ r6 o: X/ T6 { }9 e2 t+ _ 单纯培养液培养HUCBCs生长很慢，但胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、cAMP类物质等均能刺激HUCBCs生长。作者发现，PCF能够促进HUCBCs的分化。因此可以认为PCF对神经损伤的修复起着促进作用。/ S \: {+ v! w2 D! h S
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- t+ e6 ^( l- W 本实验中，必须获得大量的HUCBCs。通过数次贴壁，可以清除大量神经纤维中的成纤维细胞，而得到存有以HUCBCs为主的神经纤维片断。作者用该种神经纤维片断替代游离的HUCBCs，实验结果未受影响。因此，作者认为，采用这种方法获取HUCBCs，来源方便、快捷。7 x% U' I P2 L% ~
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0 K9 c8 N2 Y2 e: F& [: t 【参考文献】( D/ n. C$ J+ H/ c- k1 M
［1］ Ha Yoon，Choi JU，Yoon DH，et al．Neural phenotype expression of cultured humancord bloodcells mvitro［J］．Neuroscience，2001，12：3523-3527．
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9 l! V! n4 |% a% J, E& p3 v" z; b ［2］ Gordon W，Alexander JB，David WE, et al.PTK inhibitors 12 synthesis and structureactivity relationships for 6substituted 4phenylamino)pyrimido［5，4-d］pyrimidines designed as inhibitor of the eGFR［J］．J Med Chem，1997，40(12)：1820-1824.
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' J3 Z$ ?" K/ |2 M- T ［3］ 尚剑，袁绍辉，毕郑钢，等.骨髓干细胞诱导分化构件组织工程神经［J］.中国矫形外科杂志，2006，14(20)：1577-1579.- J/ x$ p; T& J M
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/ c$ ?. z( h7 L: H( w L5 j ［4］ 尹航，王晓东，张亚，等.兔骨髓间充质干细胞复合2种材料体外相容的比较［J］.中国矫形外科杂志，2006，14(20)：1571-1573.8 D5 @1 } S& w
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8 H! d( H& ~3 H2 c1 y ［6］ 刘金萍，刘新华，李海娜.扇贝多肽对脑缺血半影区Bcl-2和Bax表达的影响［J］．青海大学医学院学报，2003，39(2)：243-245． |
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发表于 2015-7-2 21:52
