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非我

新手上路

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楼主

发表于 2010-9-12 16:59 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

从基因组克隆microRNA前体有什么原则和注意事项啊
哪位高手指教一下

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exin11

版主

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沙发

发表于 2010-9-12 20:14 |只看该作者

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hljzyydx

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藤椅

发表于 2010-9-13 09:39 |只看该作者

这个要注意的问题很多9 s" [, b) C! L6 R. K" p
1.看你要插入miR的哪个部分，是Pre还是Pri，这二者是有区别的
2.你也可以直接插入miR,但是不确定是否一定会表达（建议使用病毒载体）) ?/ n) z6 {% [5 D
3.确保种子序列一定在目的片段内，这个就不必多说了
4.loop环的处理比较麻烦，你可以参考公司的建议或者根据已知文献自己设计, t. F9 i- N$ N" y0 ]2 r' m
我能想到的大概就这样吧，呵呵

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hljzyydx

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板凳

发表于 2010-9-13 09:40 |只看该作者

哦，对了，构建成功后一定要用Qpcr检测一下miR的含量，以确定是否可用

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jmsjms

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报纸

发表于 2010-9-14 10:29 |只看该作者

不同的microRNA可能要注意的事项不一样的。$ @, p( N! G' L
大部分microRNA，你可以克隆pre-miR(约100bp)+前后各200——300bp的序列直接放到CMV等PolII promoter后，polyA前，或者是放到GFP后，polyA前, H/ @7 j/ \, b: A
可以参照这篇文章7 u7 E8 L6 G. P
Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes
回复 1# 非我