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作者：彭丽萍 于振香 吕晓红 姚成作者单位：吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021 1 m2 n9 d& C5 L# g6 [
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2 F9 S: x1 c+ }. D+ \7 t 【摘要】 目的 建立体外培养人胚肺间充质干细胞（MSCs）的培养体系并探讨其部分生物学特性。方法 取3～5个月的流产胎儿，按照人骨髓MSCs的体外培养方法，获得贴壁的人胚肺细胞，研究其形态、细胞周期和体外诱导分化潜能。结果 人胚肺MSCs可在体外扩增培养，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于G0/G1期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点。其免疫表型与骨髓来源的MSCs相似。结论 从人胚肺中可分离培养出MSCs，可以在体外扩增，并可诱导向成骨、软骨和脂肪细胞分化。 1 X+ k# ]0 D. G6 o' o9 E8 F7 H
【关键词】人胚胎肺；间充质干细胞；生物学特性
& u. I- O$ q1 M6 T* y, r 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的一类多能干细胞，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、上皮细胞等多项潜能〔1〕。MSCs能在体外分离、培养和扩增，且免疫原性低。目前已在人骨髓、肝脏、脾脏、肌肉、脑、皮肤、脂肪等组织中证明有MSCs存在〔2～5〕，但对人胚肺的MSCs的生物学性状尚少有报道。本研究旨在为今后进一步开展肺成体干细胞研究提供实验基础。
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1材料与方法9 |; o- N; j4 \5 l
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11材料2 r7 p7 e6 l$ V, f* W: f
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选取15例水囊引产胎儿，胎龄3～5个月。
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2 q" t; x D! U" p8 ?6 {, k3 j12MSCs的分离和培养取胎儿肺脏，用DHank′s液反复冲洗，剪成碎块，用02%Ⅱ型胶原酶（Sigma）消化，37℃、30 min，过100目钢网，制成单细胞悬液，细胞密度为2106/ml，用含DMEM/F12，MCDB201，2黃（Gibco BRL公司）培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养，3 d后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每3 d半量换液。当细胞达80%～90%融合时，025%胰酶（Sigma）常规消化传代。
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13 细胞形态学观察
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6 D. E$ L- n; O' p1 F取1～7代MSCs，置于有小玻片的35 cm直径平皿中，37℃，饱和湿度，5%CO2培养12 d后取出，空气风干，瑞士染色，油镜下观察细胞形态。
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* d" Y" z6 L1 S& @6 U$ S; k14 细胞周期的测定
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# J. P j8 b, i( q+ ]MSCs细胞周期分析的主要试剂：RNA酶I（TaKaRa），碘化丙啶（PI，Sigma）。将胎儿肺MSCs消化，70%冷乙醇4℃固定30 min，PBS液洗涤细胞2遍，5 μg/ml PI染色（室温，5 min），用流式细胞仪（FACSVantage型）检测，Mod FIT软件分析结果。
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5 D: y( G9 [5 A+ J5 c/ o15体外诱导分化的检测
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当细胞达80%融合时，以5103/cm2接种于25 cm2培养瓶和6 cm直径的培养皿，成骨分化体系10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β磷酸甘油、005 mmol/L维生素C和10黃的IMDM；脂肪分化体系含10-6mol/L地塞米松、05 mmol/L 3isobutyl1methylxanthine（IBMX）、01 mmol/L维生素C和10黃的IMDM；成软骨分化体系DMEMHG、MCDB、2黃、地塞米松10-7mol/L、TGF 10 ng/ml。在第3、5、7、9和11天分别检测钙化小结、脂肪滴、碱性磷酸酶染色、苏丹黑染色、骨钙蛋白及脂蛋白脂酶等基因的表达，从而鉴定MSCs向成骨和成脂肪细胞分化潜能。阿尔新蓝染色法检测蛋白多糖，免疫组化法检测Ⅱ型胶原，RTPCR法检测Ⅱ型胶原基因表达等，从而鉴定人胚肺MSCs向成软骨细胞分化潜能。- y1 H! D0 B7 A& b
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21 人胚肺MSCs的一般生物学特性单个核细胞培养48～72 h后，在镜下可见散在的贴壁细胞，呈典型纺锤样成纤维细胞状，7～10 d形成放射状克隆，挑出20个克隆分别培养，约1 w形成致密的贴壁细胞层，细胞形态均一，生长速度快，易被胰酶消化，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变。以下描述中将此类细胞称为人胚肺贴壁细胞（fetal lungderived adherent cell，FLAC）（图1）。" ^ B1 } M4 ^
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8 I4 }) i1 E ^5 o+ I: H* A2 D22 细胞周期测定( C. I9 K: H+ f+ g
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用流式细胞仪测定第11、15代MSCs的DNA含量，可见处于G0/G1期的细胞多，分别为9534%、9568%，S期少，分别为413%、358%。提示体外培养的人MSCs具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期。; |, b, p% L; {& p1 S7 x$ h+ S
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23 MSCs多系诱导分化的鉴定
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FLAC在成脂肪诱导体系中培养3 d，细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短，成为立方形或多角形。连续培养7 d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合。培养2 w时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，诱导2周期后用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异的染成红色（见图2B）。成骨培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照中细胞仍是梭形且呈单层生长；80%～90%的细胞呈Apase阳性，而对照中的Apase阳性细胞较少；vonkossa染色发现在成骨培养有明显的钙化基质沉积，而对照中未见到此现象（见图2C）；RTPCR分析表明MSCs经OS诱导分化培养后表达骨钙蛋白基因。
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3讨论
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6 b7 f$ ]! O) B7 Y. h随着干细胞生物学研究的不断深入，发现某些成体组织不但能够再生其特定组织，而且可在一定的环境下转变生成其他组织系统的细胞，即跨系统甚至跨胚层分化发育，这是20世纪末干细胞领域的突破性进展之一。成体干细胞这种跨系统分化特性称为“可逆性”，成体多能干细胞的高度可塑性是近年干细胞研究领域的重要进展。在人体发育过程中多种组织中存留着具有多系分化能力的MSCs〔6〕。其作为胚胎干细胞的后代在组织中与其他各个成熟阶段的干、祖细胞共存。它们在胚胎发育成熟后逐渐丢失部分分化潜能，然后储存在某些组织器官中，应需进入细胞增殖周期，以维持人体发育和新陈代谢的平衡。因亚全能干细胞各自所处的微环境不同而向不同的组织分化，但在合适的环境下具有多系统分化潜能，最近人们已经从非造血组织如皮肤、脂肪、骨骼肌中分离出具有MSCs特征的干祖细胞。它具有多向分化潜能，能够分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞〔5，7〕。
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; E- G, U" |7 e6 p* r# |本研究发现在形态上原代人胚肺MSCs为成纤维细胞样的细胞群体，能黏附于塑料培养瓶。以梭形的成纤维样细胞为主。多次传代（17代）后，细胞为长梭形，核异染色质少，核仁明显，每传代一次细胞数约可增加2倍，表明其体外较大的扩增潜能。细胞周期测定也证明胎肺MSCs大部分（95%）处于G0/G1期，也证明我们分离的细胞表现为干细胞特性。多系诱导分化实验证明人胚肺MSCs可向成骨细胞和脂肪细胞分化，证明了其干细胞特征。; J, M+ _7 L5 {
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本研究结果证实在人胚肺中存在MSCs，应用其贴壁特性可以较好分离并在体外扩增和诱导分化。在肺脏损伤后，人胚肺MSCs可以在胚胎肺内分布，并长期定植。有研究报道从成体组织来源的MSCs可以归巢至肺脏〔5〕。在此基础上对这类细胞在肺脏组织中的作用及其调控机制进行深入研究，将为成体多能干细胞研究，肺脏体外诱导等基因工程和细胞组织工程的应用奠定实验室基础，提供良好的种子细胞来源。成体多能干细胞的深入研究对于组织损伤的修复与细胞治疗都有重要的意义。2 i+ P/ |) @8 S) l2 P
【参考文献】
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