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作者:李栋,沈柏均, 侯怀水,时庆, 张乐玲1,马秀峰作者单位:山东大学齐鲁医院低温医学研究室, 济南 250012; 1 山东大学齐鲁儿童医院内科, 济南 250022基金项目:国家自然科学基金资助,编号:30271248
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& j# V' e+ ^- \) _3 _: P y4 B 【摘要】 为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应,使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞(MSC),在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征;使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型;RT-PCR法检测其胶原表达;诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定;最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示:贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态,可传15代以上,第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44(32%),低表达造血细胞标记CD45(4.7%);RT-PCR显示高表达I型胶原,弱表达II型胶原,不表达X型胶原;在不同的诱导条件下,rBM-MSC 可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感,10 ng/ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32%以上(P
) n6 ]. C" B, l& p4 h 【关键词】骨髓; 间充质干细胞;生长因子;兔8 z: q! }8 O% n3 d- U6 e
Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors7 z" _6 a* }1 ^8 G4 C5 k% U/ ~
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LI Dong,SHEN Bai-Jun, HOU Huai-Shui, SHI Qing, ZHANG Le-Ling, MA Xiu-Feng( B3 z" G9 p; Q. n X
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Departmentof cryomedicine, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China;1Department of Internal Medicine,Qilu Children Hospital, Shandong University, Jinan 250022, China
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AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1, 3, 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed, while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In variousconditions inducting differentiation, rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast, chondrocyte, adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3, even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32%, P9 S& K, c; g, N# U1 B
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Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit
0 W. }. A6 X5 q2 b8 q' G$ L e9 C0 }8 g$ y4 {
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能,在不同的诱导条件下,可分化为多种组织细胞类型,如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞[1]。目前对人和小鼠等物种的BM-MSC
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已有深入研究,但对兔BM-MSC的生物学特性,尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大,便于进行移植和观察,对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法,在体外培养、扩增兔BM-MSC,对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究,为以后的移植模型研究奠定基础。# H% X9 @9 [/ M" |2 J0 t4 q1 C
1 C2 W% ]. K! n 材料和方法
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实验动物 5 q* |7 W! Y4 ~4 P3 G
* r0 {. h& }) V/ w$ h) |( | 3月龄雄性新西兰大白兔6只,体重1.8± 0.2公斤/只,购自山东省农科院兔场。9 x q; [, A) m% M) x" r1 h
3 T% a) f% r* j& h 兔BM-MSC的分离培养 . e4 u; W( R) {& _' Q& _7 }
( D- K% E: V. V3 l5 R
对兔按3%戊巴比妥钠1 ml/kg体重行耳缘静脉麻醉,无菌取股骨骨髓1 ml(肝素终浓度50 U/ml)。用淋巴细胞分离液(上海华精生物公司产品,相对密度1.077)获得单个核细胞,以4105/ml的密度悬浮于含10%小牛血清(杭州四季青产品)的高糖DMEM(Gibco/BRL公司产品)中,置100%湿度、5% CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液,弃非贴壁细胞,每3天全量换液,约2周后贴壁细胞铺满80%瓶底, 用0.25%胰蛋白酶(Gibco/BRL公司产品)常规消化传代。% N6 S# Y/ \- C6 i6 E
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电子显微镜观察和细胞组织化学染色
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取第5代BM-MSC进行扫描电子显微镜和透射电镜观察,并进行常规碱性磷酸酶染色(ALP)和糖原染色(PAS)。
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免疫表型检测 ; h5 U# u \) t
+ m' f- K( h! A; s0 a# u 取第5代处于对数生长期的BM-MSC,消化后用含0.1%BSA的PBS悬浮,调整密度为1106/ml,分别标记鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗体(IgG1,Serotec公司产品)10μl,室温放置30分钟;另取1管作IgG同型对照;以缓冲液洗去未结合抗体,再加入200 μlFITC-羊抗鼠二抗(IgG,BeckmanCoulter公司产品),避光孵育20分钟,缓冲液洗去未结合抗体,流式细胞仪(CYTOMICSTMFC 500型,Beckman Coulter公司产品)检测,结果用CYTOMETER 1.0软件分析。- @) n o) Q1 i$ q, E. x3 U
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诱导分化及鉴定0 j* w' D. {2 t! m; I4 P
% O Y; z! |1 D1 H" e) W
成骨细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC,约60%融合时加入成骨细胞诱导培养液(含10%小牛血清,地塞米松0.1 μmol/L,维生素C 0.2 mmol/L,β-甘油磷酸钠50 mmol/L,Sigma公司产品),每3天全量换液1次,2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。2 \2 B; Q: P b& @" k
1 k1 H/ R, z$ v# |( Z5 Y" r4 x9 {
软骨细胞取培养第5代处于对数生长期的BM-MSC,约60%融合时加入软骨细胞诱导培养液(含10%小牛血清,TGF-β1 3ng/ml(PeproTech EC公司产品),地塞米松 0.1 μmol/L,β-甘油磷酸钠 5 mmol/L,维生素C 0.2 mmol/L,胰岛素 2μg/ml,丙酮酸钠 30 μg/ml,牛血清白蛋白 0.4 mg/ml,亚硒酸 2μg/ml,亚油酸 2μg/ml,Sigma公司产品),诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达,RT-PCR检测软骨特异性Ⅱ型、Ⅹ型胶原和aggrecan基因表达。
p. e% ~* x' u: P- S/ h' n: b; f9 t1 i0 \9 _
脂肪细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC,约90%融合时加入脂肪细胞诱导培养液(含10%小牛血清,胰岛素6.25 μg/ml,地塞米松 0.1μmol/L,IBMX 0.25 mmol/L,吲哚美辛 100 μmol/L(均为Sigma公司产品),2周后油红O染色鉴定。
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5 | ]3 m: T: N1 q1 ?神经细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC,约90%融合时加入预诱导培养液(含10%小牛血清,bFGF 10 μg/L(PeproTech EC公司产品),48小时后加入神经细胞诱导培养液(含10%小牛血清,1% DMSO,BHA 50 μmol/L,Sigma公司产品),3天后RT-PCR检测神经细胞特异性nestin和NF-M基因表达,免疫组织化学鉴定神经特异性抗原NSE的表达,一抗为鼠抗兔NSE,二抗为生物素化羊抗鼠IgG(武汉博士德生物公司产品)。- X8 T1 u9 k" x5 B& E( ~
+ d: d, k/ w0 P1 S I9 ~( G+ z
基因表达的RT-PCR检测 4 Z+ Y# f# r1 \& y
4 `6 \# Q/ \5 P3 J+ g2 n' k 细胞总RNA提取使用TRIzoL试剂 (Invitrogen公司产品),反转录按照RT-PCR试剂盒(购于北京博大泰克生物公司)说明书操作。所得cDNA用于PCR扩增,引物见附表(上海博亚生物公司合成):扩增程序为95℃ 30秒,65℃ 45秒,72℃ 45秒,5个循环;95℃ 30秒,60℃ 45秒,72℃ 45秒,20个循环;95℃ 30秒,55℃ 45秒,72℃ 45秒,4个循环;最后72℃ 延伸10 分钟,PCR产物使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。
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; S3 |, f3 {. g, l: M u3 ^) r 不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响# \# U) j( ]( H( R6 Y% {2 b" n) j
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取第5代处于对数生长期的BM-MSC,以2 000个细胞/孔的密度培养于96孔板中,培养基为含10%小牛血清的高糖DMEM,分别加入不同浓度的IL-1、3、8和HGF(PeproTech EC公司产品),每组设12个复孔,培养48小时后常规MTT法检测MSC对不同生长因子的增殖反应,酶联检测仪(INTEC公司产品,Reader 2010型)检测492nm处吸光值。Table.Primer sequence(略)
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; C, s! D o. F 统计学处理
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计量数据用X SD表示,组间差异分析用 t 检验,P
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结果
& h) S- F; X7 d4 L i" D5 X+ g# }' M+ g& z( Q. F+ L
细胞形态及特异性染色
: N) `" L3 S) S3 P) `& W1 r+ K
e7 p( @3 H3 P1 D0 [) a0 h* B 兔骨髓单个核细胞在贴壁培养72小时后可见少量细胞贴壁,10天后BM-MSC能铺满80%瓶底,以成纤维样细胞为主,HE染色可见核内有2-4个明显核仁(图1A);扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑(图1B),少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶;透射电子显微镜观察显示,膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数,该细胞核与细胞质比约为1∶5,细胞核中常染色质丰富、分布均匀,图1C可见双核仁,核仁大而结构清晰,核膜完整,可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体,胞质中分别有大量核糖体和微丝。BM-MSC细胞膜微绒毛较多,靠近这些突起的细胞质中分布有致密的微丝,形成一条高电子密度带(图1D)。细胞化学染色2%-3%的细胞碱性磷酸酶阳性,在胞质内有红棕色沉淀,阳性细胞在形态上与阴性细胞没有差异(图1E);糖原染色全部细胞均为阳性,胞质含大量紫红色糖原颗粒(图1F)。! `9 b% I' ~- C K- d7 Z
1 k% e. B; q/ Z+ x" G
诱导分化结果及其鉴定( o3 f1 J' c. v3 l& m+ ?
2 B' N4 m4 \* e, J/ W) j# [
加入成骨细胞诱导培养液2-3天后,细胞开始从长梭形缩短为多角形,细胞体积增大,诱导14天后茜素红S染色为阳性,碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加,表现出成骨细胞的特点(图2A-C);加入软骨细胞诱导培养液后,细胞由长梭形显著缩短为椭圆形,体积增大,甲苯胺蓝染色呈阳性(图2 D、E)。RT-PCR结果表明其表达软骨细胞特异性的aggrecan基因,Ⅱ型胶原的基因表达也较诱导前增多,表现为软骨细胞分化的特点;但Ⅹ型胶原不表达(图2 I: 1-4);成脂肪细胞诱导后细胞胞浆内开始出现细小脂滴,细胞排列无序,显微镜下可观察到高折光性的脂滴。油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴(图2F);神经预诱导剂加入后细胞形态变得细长,加入二次诱导剂后6小时内约有60%的细胞死亡脱壁,剩余的细胞有50%表现为神经元样细胞特有的形态,伸出细长的伪足(图2G,H)。这些细胞表现为NSE免疫组化染色阳性;RT-PCR结果显示其表达神经细胞特异性基因Nestin和NF-M(图2 I: 5-6泳道)。
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& z/ @6 m1 m9 r: |0 @ 细胞表型及RT-PCR检测- W6 `- X* O h% h& z1 q
0 p1 O7 `: ]2 V- w- p 兔BM-MSC细胞上CD44抗原表达阳性率为32%;CD45表达阳性率为4.7%,MHC-Ⅰ型分子表达阳性率为1.8%;流式细胞仪测定结果见图3A-D。RT-PCR显示第5代的兔BM-MSC高表达Ⅰ型胶原,弱表达Ⅱ型胶原,不表达X型胶原、aggrecan、nestin和NF-M基因(图3E)。
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: N5 |4 V0 M6 f7 s2 _! @0 m 不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响- n @+ B5 G2 J' H5 ?( A
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酶联检测和MTT结果显示,兔BM-MSC对IL-1、3、8和HGF的反应模式基本相同,均为低浓度促进兔BM-MSC的增殖,高浓度反而抑制细胞生长,抑制效应随细胞因子浓度增加而增加;兔BM-MSC对IL-3的反应最为明显,10 ng/ml的IL-3可显著促进细胞增殖达32%以上(P( C5 ?, _" C9 l! ~# B) w) F
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讨论2 F3 p( d8 q# _
~8 u: K- K$ W6 {! y 目前分离MSC的方法多基于其黏附贴壁和体外快速增殖能力,鉴定MSC则主要是根据其形态和功能。目前普遍认为BM-MSC表达CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR[2]。由于兔基因组计划尚未完成,兔分化抗原的抗体难以得到,本实验仅能选择CD44和CD45。细胞黏附分子CD44属于基质受体(matrix receptor),是分布极为广泛的细胞表面单链穿膜糖蛋白,在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达,专一性结合透明质酸盐并介导其内吞,在细胞-细胞和细胞-基质间作用中发挥重要作用[3]。我们的实验结果显示,约1/3的兔BM-MSC表达CD44,与猕猴BM-MSC的数据相同[4],但较人BM-MSC的数据(>94%)为低[5],这证明了物种间存在差异。我们培养得到的兔BM-MSC高表达I型胶原,弱表达Ⅱ型胶原,不表达Ⅹ型胶原和aggrecan基因。胶原是细胞外基质的主要成分之一,目前已发现 19种胶原分子,I型胶原的分泌是MSC的标志之一,可有效地促进BM-MSC的黏附、增殖和分化[6],有关报道证明,如将人BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化,则aggrecan基因、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达就会显著增加[7],我们的试验结果显示,将兔BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化后,表达aggrecan基因和Ⅱ型胶原,而不表达Ⅹ型胶原,这与人BM-MSC数据有差异。兔BM-MSC除向软骨细胞分化以外,我们还成功地使其诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明了其具有多向分化潜能。骨髓中BM-MSC的含量仅占1/106个有核细胞,并且随着年龄的增加或体质的衰弱,BM-MSC的数量逐渐减少[8]。因此要获得足量的MSC,大量扩增纯化是十分必要的。根据我们的实验结果, 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度,倍增时间约为40小时,细胞形态狭长;从1 ml骨髓中获得的BM-MSC传代7-8次所得细胞数目可达5108,已经能够足够满足体内移植和一般实验研究所需。随着重复传代,细胞变得宽大,生长速度下降,这和人BM-MSC中的研究结果相似,随着BM-MSC的衰老,其对生长因子的反应能力和多向分化能力也会显著下降[9]。BM-MSC除表达IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多种细胞因子外,还能对bFGF、BMP、胰岛素、TGF-β1和HGF等多种细胞因子作出增殖或分化响应,证明其表达多种因子受体[11-13]。本实验检测了不同浓度的人IL-1、3、8和HGF对兔BM-MSC生长的影响。结果显示,低浓度的人IL-1、3、8和HGF能促进兔BM-MSC的增殖,而高浓度则抑制其增殖,其中低浓度IL-3对兔BM-MSC的促增殖作用最为显著,而高浓度的IL-3的抑制效果也较其他细胞因子明显。BM-MSC本身不表达IL-1和IL-3[11,13],IL-3主要由活化的T细胞产生, 而IL-3受体主要表达于造血细胞上并介导造血细胞的增殖、分化或激活。有文献表明,人脐静脉内皮细胞也表达IL-3受体,并可被TNF或IFN上调。混合IL-3 和IFN可上调脐静脉内皮细胞表达MHC II类分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生长因子[14]。根据我们的结果,IL-3受体也表达于BM-MSC,IL-3可能通过IL-3受体促进BM-MSC的增殖并使其表达更多的造血生长因子。总之,本研究成功地分离、培养了兔BM-MSC,检测了其免疫表型和多向分化能力,与文献报道的其他物种MSC的特性类似,并检测了不同生长因子对其生长增殖的影响,为下一步应用兔作为移植模型的研究奠定了基础。7 o( _2 P. n- a8 ^4 ?5 K
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