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作者：邱匀峰作者单位：东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009
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4 H# D1 {2 T- C7 j( Y8 E 【摘要】 目的：建立骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的模型，研究间充质干细胞对体外培养的髓核细胞活性的影响。方法：通过transwell插入式培养皿构建间充质干细胞髓核细胞共培养模型,观察共培养条件下髓核细胞形态变化，计数细胞增殖，ELISA方法检测蛋白多糖含量变化。结果：经过8 d共培养,实验组中的髓核细胞计数较对照组增加明显(P2 b" L/ `2 R- l1 I$ B
【关键词】椎间盘退变 髓核 骨髓间充质干细胞 培养6 e( x; X0 A. H) T+ j8 b
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）引起的下腰痛是一种常见的骨科疾患，其具体机制不明。临床常用的保守治疗和手术方法虽然能缓解临床症状或取得一定的治疗效果，但并非是针对椎间盘退变本身，远期效果并不理想。组织工程学的发展为解决这一难题提供了一种新的选择。Nishimura等[1]发现通过早期移植自体髓核细胞可减缓甚至有逆转IDD发生的可能。髓核是乏细胞组织，而且髓核细胞体外培养表现出增殖缓慢[2]，因此如何在体外培养时促进髓核细胞增殖并维持其表型成为研究细胞移植治疗IDD首先要解决的问题。本研究通过拟建立共培养模型探讨骨髓间充质干细胞对髓核细胞活性的影响。
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2 n5 g4 v( w& S1 S, U1材料与方法8 t. C' B. \1 t+ J: n" o1 w" }" \
+ p0 z3 I' Q* C0 t# Y. A) O2 l1.1材料
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1.1.1主要材料和试剂二氧化碳孵箱（德国Hereaus），Transwell细胞培养板（美国Corning），Percoll淋巴细胞分离液、DMEM/F12培养基（美国Sigma），胎牛血清（杭州四季青公司），ELISA透明质酸检测试剂盒（美国Corgenix，批号029001）。2 V" j0 F5 r7 F# J# X- g: c( n
- L R. x2 H' Q3 v4 ^! l: @1.1.2细胞来源在取得知情同意后，1例髓核组织标本取自因腰椎压缩性骨折而进行手术治疗的患者,L1/L2椎间盘，男性，28岁；1例骨髓标本取自因胫腓骨双骨折行手术治疗患者，男性，19岁。# ^, Q2 G8 ]" A# C9 ~' }
5 x6 D3 ^% x9 W. J j) o# S1.2细胞培养
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1.2.1间充质干细胞培养将5 ml注射器内预先抽吸含有5 000 U·L-1肝素的无菌PBS液2 ml，取术中新鲜骨髓标本约1 ml，迅速将注射器内液体均匀混合，无菌条件下立即带回实验室，在超净台内用等体积PBS液稀释，缓慢注入含有等体积、相对体积质量为1.077的淋巴细胞分离液作梯度离心（2 000 r·min-1,离心30 min）,收集单个核细胞，洗涤3次后用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬1105接种底面积为25 cm2培养皿，37 ℃、5% CO2培养于孵箱，第3天首次换液，以后每2 3 d换液1次。待细胞接近90%融合，0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3传代。传至第3代(P3代)行流式细胞仪鉴定，并冻存备用。复苏后培养7 d后，按1104接种于transwell 6孔板底部，共接种12孔。接种后4 h，在上层插槽中进行髓核细胞种植。 e0 ^+ s% o# P
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1.2.2髓核细胞培养取手术摘除的髓核组织标本，置入预先准备好的内含少量DMEM/F12培养液的无菌培养瓶并置入冰盒内迅速带回实验室。0.5 h内在超净台内剪碎消化培养。在无菌超净工作台中,将取出的髓核组织用PBS液冲洗3次去除血污。将组织剪碎成1 mm1 mm1 mm大小的碎块。37 ℃下以0.25%的胰蛋白酶消化组织20 min。800 r·min-1离心5 min,弃去上清液。36.5 ℃下用0.2%的Ⅱ型胶原酶静置消化4 h,至组织块逐渐消失。800 r·min－1离心5 min,去除上清液;用DMEM/F12培养液吹匀细胞,再次离心,重复3次。用计数板进行细胞计数，按1104接种于transwell 6孔板上层插槽中,共12孔。另取两块transwell普通6孔培养板，按1104接种12孔，单独培养髓核细胞作为空白对照组。加入5 ml含青霉素100 U·ml-1、链霉素100 U·ml-1和10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液。37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每2 3 d换液1次。每2 d用倒置相差显微镜进行观察、拍照。
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1.2.3检测待观察到实验组髓核细胞达到90%融合，37 ℃下以0.25%的胰蛋白酶消化各孔细胞，分别用细胞计数板计数;并收集各孔上清液以检测蛋白多糖，操作严格按照ELISA透明质酸检测试剂盒（美国Corgenix）说明书要求。
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# Q4 j$ D s% A1.3统计学处理1 y' C4 q4 q! I
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计量资料以x-±s表示，采用t检验。
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9 @5 N, [) p- x+ y4 J0 Z+ |2结果& K5 x7 y9 D" |8 `! H& |3 t
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2.1髓核细胞形态观察9 g( c* D" K) u) e( m
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对照组髓核细胞的贴壁时间较长，24 h后开始有少量细胞贴壁（图1A），5 d后换液时可达80%贴壁。髓核细胞呈多角形或圆形，胞浆内含少量空泡，贴壁后伸出伪足。实验组12 h后开始贴壁，48 h内可达90%贴壁。
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2.2间充质干细胞形态观察及分析
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; y% z/ |) x! i3 ]7 w原代细胞接种24 h后，细胞开始贴壁，形态由圆形变为梭形、多角形，胞体细长，并形成数个集落。3 d左右可见大部分细胞伸出伪足，贴壁生长，并贴壁延伸，逐渐形成集落（图1B）。生长至2周左右，90%细胞融合，可以传代。经0.25%胰蛋白酶消化后的细胞呈圆形，12 h内细胞开始贴壁。传代后的细胞增殖加速，14 d左右90%即可以再次传代。经复苏后的冻存细胞2 d左右可恢复梭形形态，并贴壁生长，10 d左右形成融合单细胞层，可以传代。间充质干细胞进行共培养前后形态没有明显变化。P3代骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测表面标志(图2)。A. 对照组贴壁后的髓核细胞呈多角形、圆形和梭形,数量较少（200）；B. 3 d左右间充质干细胞伸出伪足，贴壁生长，并贴壁延伸（100）;C. 共培养后第8天髓核细胞已经融合(200）经检测该细胞系CD44表达阴性，CD34、CD45表达阳性- ^$ @0 C& p7 g2 Z+ O* j# s) c
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2.3共培养分析
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8 p$ \0 N; z" x8 h7 Z经共培养8 d后，实验组中髓核细胞已基本融合，而对照组中髓核细胞仍然呈散在分布。髓核细胞进行共培养前、后形态没有明显变化(图1C)。实验组各孔髓核细胞达到90%融合，将实验组及对照组髓核细胞0.25%胰蛋白酶消化后用细胞计数板计数；同时收集各组上清，ELISA法检测蛋白多糖。结果见表1。表1髓核细胞数与蛋白多糖检测结果（& D; g4 y5 j, [' U
! `, O7 Q3 C/ R3讨论
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: N* R1 T3 d# @1 y椎间盘由位于外层的纤维环、内层的髓核、两者间的移行区以及上下终板构成。髓核内有脊索细胞和软骨样细胞两种细胞类型,在胚胎22周前脊索细胞占优势，26周以后脊索细胞的比例不断下降，成年后则几乎完全被纤维软骨样细胞所替代。细胞的生长在很大程度上取决于局部微环境，也受到细胞间相互作用的影响。Aquiar等[3]将提纯后狗脊索细胞与成年牛退变髓核细胞在藻酸盐珠载体上共培养后发现,细胞数目无明显增殖，但髓核细胞的蛋白多糖合成能力明显提高，而将同样比例的未退变髓核细胞与退变髓核细胞共同培养，则不发生上述结果，证实脊索细胞在保持椎间盘完整性方面具有重要作用，并推测脊索细胞和髓核细胞在保持椎间盘组织完整性方面有着某种协同效应。Okuma等[4]证实髓核细胞和纤维环细胞共培养后，DNA合成和细胞数分别较两种细胞单独培养增加，而细胞的形态和活性无明显改变。* `' A" v% Z& Y9 `7 n
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骨髓间充质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨基质细胞。随着组织工程学的发展，骨髓间充质干细胞作为一种具有多种分化潜能的种子细胞越来越受到人们的关注和研究。但实际上，人们认识骨髓间充质干细胞的功能是从对造血组织的支持和调控造血的作用开始的，近年来研究发现该类细胞在体内、外对共培养的其它组织和细胞也有支持和辅助作用[56]。纤维环及移行区的组织均来源于间充质，采用比纤维环分化更早期的间充质干细胞与髓核细胞共培养理论上也存在上调髓核细胞活性的可能，我们的研究发现证明了这种可能性的存在。目前对人类骨髓间充质干细胞细胞表面标记物的研究结果存在争议，尚无统一的标记物，但普遍认为骨髓间充质干细胞不表达造血细胞的表面标记。我们用流式细胞仪测定了培养细胞的细胞膜抗原，该细胞系CD44阳性表达，而作为造血干细胞的标志抗原CD34、CD45阴性表达，说明培养的细胞不是骨髓中的另一大类细胞造血干细胞，这和李秀森等[7]的研究结果是一致的。
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( p0 A+ z- i3 l9 r9 J6 }' h) V本实验采用transwell插入式共培养系统，采用这种培养系统较传统三维培养更便于观察细胞的形态学特征，更易检测细胞代谢物质，施加干预因素也比较方便。该系统上层插槽底膜的孔径为0.4 μm,相对分子质量大于70 000的细胞成分（如蛋白多糖）不能通过。实际上,多种在体外培养中被证明[8]能够促进髓核细胞增殖和维持细胞表型的细胞因子，如IGF1、TGFβ、EGF、PDGF等相对分子质量均不超过70 000，可以通过底膜。Yamamoto等[9]证实，通过髓核细胞和间充质干细胞的直接接触后,上清液中来源于骨髓间充质干细胞的IGF1、TGFβ1(25 000)、EGF、PDGF含量明显增加。我们推测髓核细胞与骨髓基质干细胞共培养后，髓核细胞活性上调与共培养系统在一定程度上模拟了椎间盘局部微环境，以及体外培养中髓核细胞与间充质干细胞存在某种协同作用有关，具体机制还需进一步实验研究。在体外模型中骨髓间充质干细胞具有抑制异源性免疫作用[10]，本实验采用同种异体的骨髓间充质干细胞，因为没有免疫系统的参与，在实验过程中并没有发现可见的免疫排斥反应，共培养后髓核与间充质干细胞生长良好，但此模式是否能运用到体内环境还需要进一步更长期的观察。* u$ y9 |# V; c8 }$ b* M1 h2 f1 }4 X
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髓核细胞并无特异性表面标志，比较公认的是其表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖成分。Gruber等[11]研究发现单层培养时髓核细胞胶原表达不良，利用免疫组化的方法只有三维培养中才能检测出Ⅱ型胶原，而蛋白多糖合成不受培养方式的影响。因此本实验采用蛋白多糖作为检测髓核活性的指标之一。蛋白多糖是由蛋白质和糖胺聚糖通过共价键联结而成的蛋白质。椎间盘中主要有硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸3种糖胺多聚糖。细胞外间质中的蛋白多糖大多以聚合体的形式存在，大量的蛋白多糖单体通过核心蛋白的透明质酸连接点非共价地与透明质酸链结合，而连接蛋白于二者之间，使蛋白多糖聚合体更加稳固。蛋白多糖以其核心蛋白上的透明质酸连接点连接于透明质酸，这一连接具有高度特异性，尚未发现透明质酸与其它蛋白相连接，所以测出透明质酸含量就可以推断出蛋白多糖的含量[12]。5 G0 |, D5 b3 X. l6 ~
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胎儿期和幼年期,椎间盘内类软骨细胞、脊索细胞等均可产生多种内源性生长因子,如TGFβ1等。生长因子共同作用于椎间盘细胞的分裂、生长、成熟、凋亡各阶段，随年龄增加,生长因子表达量逐渐减少。在椎间盘细胞体外培养时添加或将其基因导入椎间盘细胞，形成基因细胞可在一定程度上促进细胞增殖、分泌细胞外基质，并维持细胞活性。外源性生长因子等蛋白制剂半衰期短，不能长期在体内发挥作用，临床上无法广泛应用。利用生物科技手段，以病毒为载体，将特定基因转染体内的椎间盘细胞，能持续性地发挥细胞因子作用，达到促进椎间盘细胞增殖、椎间盘细胞表型表达时间延长的目的。但多年来，基因工程的安全性是生物医学界一个有争议的话题。骨髓间充质干细胞采集容易，体外培养时易于分离、扩增，与髓核细胞共培养后促进髓核增殖、细胞外基质的表达，为研究体外增殖髓核细胞提供了一种安全有益的选择。
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发表于 2015-6-28 09:43
