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作者：詹焱综述，马涤辉，张昱审校
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【关键词】神经干细胞分化增殖
+ ~3 w7 t; ] d; j1 D( l+ j& j The differentiation and proliferation of neural stem cell and its application in treatment of central nervous system illness.
! N, e8 d/ T3 @0 t& V' A7 Z. h ZHAN Yan，MA Di-hui，ZHANG Yu.: h* W2 r. s* O2 o+ N* d% [& J
（The First Clinical Hospital of Jilin University，Changchun130021，Jilin，P.R.China） 1 神经干细胞 1.1 存在、来源 1992年，Reynolds等 ［1］ 从成年鼠脑纹状体中首次分离出能在体外持续增殖且具有向神经元及星形胶质细胞分化潜能的细胞群;表明在成年鼠脑内存在着具有干细胞特性的细胞群。1998年，Eriksson等 ［2］ 证实成年人脑同样存在神经干细胞，使人们对神经系统再生的机制和神经系统疾病的治疗均有了新的认识。 干细胞即起源细胞，一般指那些同时具有自我更新和分化、再生细胞能力的细胞。就NSC而言，它必须是具有分化为神经元、少突胶质细胞、星形细胞潜能的细胞，且能有效地自我更新以保证脑内的细胞数。神经干细胞的另一特性是可以具有对称分裂和不对称分裂两种方式，而通常的干细胞仅具有不对称分裂。在对称分裂时可以产生两个子代干细胞或两个祖细胞。而在不对称分裂的情况下则产生一个干细胞及一个祖细胞。在神经干细胞中可以检测到神经上皮干细胞蛋白（Nestin）。Nestin编码了一个中等纤维骨架蛋白，系早期原始神经细胞的标志，已广泛应用于神经干细胞的鉴定。目前认为Nestin可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化以及有丝分裂后神经元间神经联系的建立。 1.2 鼠胎脑和成年脑的神经干细胞分离 胎脑中分离:Johe等 ［3］ 将E14大鼠皮质、纹状体和E16大鼠海马即刻分离的组织进行消化、培养，通过克隆分析发现，胚脑中存在大量NSC。Morrison等从E14～E17胚胎大鼠中分离坐骨神经，利用细胞表面标志和流式细胞仪分离出P75 Po-细胞，并通过体内分化实验证实为NSC。Qian等 ［4］ 从不同胚龄胚鼠脑皮质中获得神经干细胞，发现神经元产生早于胶质细胞，E10和低浓度表皮生长因子（EGF）011ng/ml有利于向神经元分化，E12和高EGF10ng/ml则分化为胶质细胞，并推测环境因素（FGF2、EGF等）可能起了不同分化的开关作用。 成年脑组织分离:有人从新生鼠脑中分离海马，培养后发现少数细胞存活并形成细胞团且巢蛋白（nestin）反应阳性，含有神经中丝，首次证实了成年脑中存在NSC。此后又在脑的不同部位分离出NSC。Johansson等 ［5］ 分离小鼠侧脑室侧壁组织，首次从大量组织细胞中分离出纯化的NSC。同时认为，海马中的NSC可能是在神经发生过程中因侧脑室扩大而潴留的室管膜细胞。Kuhn等 ［6］ 运用检测BrdU整合及神经元标志物NeuN和calbindin2D28k双抗体染色的方法，证实成年大鼠海马齿状回的NSCs数目和神经发生随年龄增长而降低。可以部分解释老年脑的重塑功能下降。 9 ^# w2 t4 B& ^& f' F
2 海马区神经干细胞培养分化影响因素 海马是目前认为与学习记忆等高级功能具有密切关系的重要结构。其结构和功能的异常改变，是多种中枢神经疾病（如癫痫、早老性痴呆等）的病理学基础。现已证明海马齿状回存在神经干细胞是成体脑内具有神经生发活动的少数区域之一，并且它可以不断产生神经元持续终生。离体的海马的神经干细胞的分化和增殖受到多种信号的调节，体内体外的因素也可以影响或干预体内的海马齿状回的神经生发活动。可能为中枢神经系统损伤与变性疾病的研究与治疗提供新的途径。如果能够明确这些神经干细胞分化和增殖的调控因子，则不但可以控制其向某一特殊类型的细胞分化的方向，从而大大丰富了神经移植供体的来源，而且在神经变性疾病和神经损伤患者中，可以通过向特定脑区移植入某种特定的调控因子，诱导干细胞的分化和修复病灶。这已成为国内外学者研究的焦点，主要集中在以下几个方面。 2.1 体外培养分化影响因素 基因调控 遗传性状在多个水平影响神经发生和细胞分化表型。bHLH转录调控因子（basic helix2loop2helix transcrip-tion factor）参与神经干细胞的分化。在小鼠发育过程中，部分bHLH基因在处于早期有丝分裂期的神经前体细胞中表达，部分在较迟的有丝分裂后细胞表达。根据bHLH转录调控因子在神经分化过程中先后作用，分为决定因子和分化因子。决定因子基因包括MASH21、MATH21、MATH24A和Ngns，这些基因是小鼠胚胎发育的极早期表达、分化所必需的。最近的研究显示，编码bHLH转录因子的Olig基因决定少突胶质细胞的分化，同时，Olig2选择性表达运动神经元的前体细胞，与Ngn2共同调节灵长类运动神经元的亚型和特性。N2CoR作为转录抑制因子阻止神经干细胞向胶质细胞分化。N2CoR基因突变鼠的胚胎干细胞对FGF2的增殖反应降低，可分化成星形胶质样细胞。 外来信号的调控 生长因子在神经干细胞和祖细胞的分化发育中的作用越来越多地受到重视，其中丝裂原样的生长因子信号在增殖过程中起着相当重要的作用，已用于维系干细胞特性的丝裂原信号主要包括表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。但两种生长因子对神经干细胞促增殖作用的时间不同。bFGF2在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用，使神经干细胞获得对另一作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性;而EGF在神经干细胞增殖后期发挥作用，EGF主要作用是促进神经干细胞的长期存活。bFGF和EGF对神经干细胞分化方向的作用也不相同，bFGF2bFGF则可能对于神经干细胞向神经元和部分程度的向胶质细胞分化起到一定的作用，能增加干细胞向神经元分化的比例，而EGF敏感的干细胞生成的神经元常少于1%，绝大多数是星形胶质细胞，且这两种生长因子作用的神经干细胞分化形成的神经元多为γ2氨基丁酸（GABA）能神经元。 细胞因子 其对于神经系统尤其是间脑细胞发育和成熟的作用越来越受到重视。在脑中已先后发现许多细胞因子，如红细胞生成素，集落刺激因子，白介素家族等，且证明他们能够影响神经元的发育。已证明主要促进神经元树突的生长及神经营养作用，其单独并不能对神经干细胞起到诱导分化和增殖的作用。脑源性神经营养因子（BDNF）和胰岛素样生长因子可以增加EGF依赖性的黑质干细胞分化成的神经元的数量，其机制可能是通过上调干细胞后代中转录因子Brn24介导的。另外，BDNF可使神经干细胞分化为GABA能神经元的比例达70%，而神经营养素23（NT23）则使分化为谷氨酸能神经元的比例高达96%。白细胞介素（IL）21和淋巴细胞抑制因子（L IF）可以显著提高细胞生长率，IL26、IL211、IL212、L IF和粒细胞克隆刺激因子对少突胶质细胞系的成熟有诱导作用。L IF等因子通过L IF受体在发育期及成熟神经系统内发挥各种作用，通过JAKPSTAT途径决定神经前体细胞向神经元分化还是向胶质细胞分化。 细胞外基质神经细胞粘附分子（Neural cell adhesion-molecules，N2CAMs）是细胞外基质蛋白，参与细胞间的相互作用，并调控神经干细胞的增殖、迁移、分化。实验表明，N2CAMs可以抑制海马前体细胞的增殖，呈剂量依赖性，并诱导其向神经元方向分化。Reelin是细胞外基质中分子量较大的蛋白，与神经元细胞膜上的整合素受体α3亚单位结合发挥作用。Kim等在体外培养的人神经干细胞膜表面也检测到了Reelin及其受体，将神经干细胞移植进侧脑室后，Reelin及其受体阳性的干细胞迁移至皮层;相反，Reelin及其受体阴性的细胞迁移停止而在脑室下区（SVZ）增殖。研究者认为，精神病人正是由于缺乏Reelin，抑制了神经干细胞的正常迁移而发病。 骨形态发生蛋白（BMP）在神经系统发育中也发挥多种作用，并对神经营养因子的作用产生影响。BMP2或BMP7增强出生后和成体神经前体细胞向星型胶质细胞分化，抑制向少突胶质细胞分化，且不依赖于EGF受体的激活。BMP可诱导神经嵴干细胞分化成自主神经元，在低氧水平（1%）时，分化后的细胞表达酪氨酸羟化酶、多巴胺羟化酶和交感肾上腺能神经元的标志SA21，合成释放多巴胺和去甲肾上腺素。 AN2是小鼠少突胶质前体细胞的膜蛋白，用抗体封闭后抑制其迁移。大鼠NG2是AN2的类似物，AN2PNG2阳性神经干细胞表达PDGF2α受体，具有胶质前体细胞的电生理学特性。视黄酸（RA）通过提高神经干细胞内p21的表达，使其退出细胞周期进入分化，能够诱导源于成年大鼠海马的多潜能细胞分化为神经元，且上调trk受体，神经营养因子作用于此受体后，能促进细胞进一步成熟，有时能诱导出多巴胺神经元。 其它天门氨酸受体的活性、肾上腺糖皮质激素、损伤刺激及神经生长因子都可以影响海马的神经发生与分化，Nacher等报道应用NMDA受体拮抗剂可以刺激神经干细胞的增殖活动，齿状回颗粒层内nestin阳性细胞数及BrdU阳性细胞数明显增多，位于颗粒层最内区的PSA2NCAM阳性的新生神经元数也明 显增多，一次使用CGP43487（竞争性NMDA受体拮抗剂），上述三者数量上的增加可持续7d。同时还发现，虽然刺激神经元生成，但不刺激小胶质及星形胶质的增殖及活性。这与Gould等的研究相吻合。急性使用皮质醇可以引起门区3H2thymidine标记的细胞数明显下降，相反，祛除内源性皮质醇可以刺激神经元的生长，肾上腺切除后可以见到3H2thymi2dine/NSE的细胞明显增加。这些资料说明成年大鼠齿状回的神经发生与循环血液中的肾上腺皮质激素水平有密切的关系。检测齿状回的皮质激素受体活性，发现3H2thymidine标记的分裂细胞上受体水平很低，而应用3H2thymidine后的第4周，大量的3H2thymidine阳性细胞呈现出受体阳性。这说明肾上腺皮质激素并非直接作用于颗粒细胞的前体细胞而调节神经发生的。甲状腺素（T3）可以促进神经干细胞向少突胶质细胞分化，在分化过程中，视网膜母细胞瘤蛋白表达逐渐降低，同时细胞周期素D1、细胞周期素依赖性激酶cdk2、cdk4水平也下降。 2.2 体内的宿主因素 移植区域的信号在神经干细胞移植试验中发现移植后干细胞的分化结果与宿主临近区域细胞相类似，即使同一来源的神经干细胞移植到不同部位后其分化结果也各不相同，但都与受体细胞相似。如皮层区的信号可以诱导神经干细胞分化为与锥体细胞和星形胶质细胞形态相似的细胞;来自纹状体区域的信号可以诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元;脱髓鞘白质区域移植祖细胞后可大量向少突胶质细胞分化。这些结果提示神经干细胞或祖细胞在发育过程中受到了外来信号，尤其是接触区域外来信号的影响，使其分化为与移植区域相类似的细胞。 首先，脑内局部的微环境也可影响神经干细胞移植后的分化。将神经干细胞分别植入大鼠的海马和室管膜下区，发现植入海马的神经干细胞迁移到齿状回的内颗粒层，分化为内颗粒层神经细胞;而植入到室管膜下区的神经干细胞可与大鼠的内源性神经干细胞一起迁移到嗅球分化为嗅球球旁层神经元。将扩增的神经干细胞分别植入新生大鼠的海马、纹状体和新皮层，4wk后发现植入不同部位的细胞在形态上已有差别。 Alcksandrova等 ［7］ 在未应用免疫抑制剂的情况下，将源于胚胎大鼠和人胚的神经干细胞分别移植于出生后及成年大鼠脑内，以了解神经干细胞在脑内移植后的迁移与分化。来源于15d的胚胎大鼠的神经干细胞在植入成年大鼠脑内后可以连续地分裂、迁移，形成胶质细胞和神经元，表达特异性的神经递质和神经肽。 亦有学者 ［8］ 分别将来源于下丘脑和取自小脑的干细胞移植于新生鼠的海马和小脑，发现这些移植细胞不仅能在宿主体内很好地存活，而且可以分化为与移植部位相对应的细胞。由于神经干细胞在去除丝裂原信号后分化为神经细胞，不再具有增生能力，移植后不具有致瘤性。因此，神经干细胞已具备了成为理想神经移植的供体的条件，将为脑组织移植治疗神经退行性疾病提供大量、可靠、方便的供体来源。 在不同因素影响下，神经干细胞还具有横向分化潜能，如把胎鼠或成年鼠前脑神经干细胞移植给经亚致死量照射破坏了造血系统的同种宿主，发现后者出现了供者源性的骨髓样细胞、淋巴细胞和早期的造血干细胞;把从人胚胎和成年小鼠快速分离的神经干细胞与成肌细胞共培养，结果神经干细胞分化为骨骼肌细胞。larke等 ［9］ 发现，成年鼠脑的干细胞能在鸡胚环境中被诱导形成所有的胚层。这些研究结果显示，环境的指导性信号对神经干细胞分化的重要作用，同时也证实了神经干细胞有着更大的分化潜能，为神经干细胞移植治疗多种不同疾病提供了依据。 3 神经干细胞移植治疗神经系统疾病 以帕金森病和阿尔茨海默病为代表的中枢神经系统退行性疾病是神经系统疾病中治疗的难点之一。探索新的治疗方案已经成为人们研究的热点。以人胚胎神经组织作为供体的神经移植已经为治疗帕金森病和阿尔茨海默病提供了有效的手段。然而由于从人胚获得供体组织所引起的伦理道德问题和供体来源的有限性极大地限制了该方法的广泛使用。而使用干细胞则可以克服这些问题。首先，神经干细胞可以在体外大量扩增，其次，通过体外扩增来源于患者本人的干细胞经重新移植入病损脑组织，可以避免免疫排斥反应的发生。 尽管成年脑内存在NSC，但损伤发生后完全依靠其增殖分化来进行神经修复还是不够的。目前已经能够从发育中的甚至成年的中枢神经系统中分离出具有多种潜能的祖细胞或干细胞特性的细胞，并可将其在体外培养成永生化的神经干细胞系。科学家试图通过移植NSC来修复神经系统功能。迄今进行的大量动物实验证明 ［10］ ，神经替代和部分重建神经回路是可能的。NSC移植的效果很大程度上取决于植入的NSC在结构和功能上与宿主神经系统的整合程度。移植到体内的NSC发挥治疗作用需要与宿主神经元形成突触连接和建立功能性神经回路，释放神经递质，产生神经营养因子或保护因子，改变脑组织对损伤的反应，帮助结构修复。 改善认知功能:脊椎动物的大脑终生具有产生新神经细胞的能力，这些新形成的神经细胞参与海马依赖性的记忆过程。Qu等 ［11］ 把神经球状态的未分化人NSC（HNSCs）移植到青年和老年大鼠侧脑室，30d后，移植的HNSCs分化成神经细胞和星形胶质细胞，这些细胞以非常有序的模式迁移到海马和皮层部位，形态学显示BrdU标记阳性的细胞沿侧脑室壁分布，有一些细胞则直接迁移到脑室内壁，而且与宿主脑建立了功能性联接。用Morris水迷宫评价动物的认知功能，发现由衰老引起的记忆损伤大鼠在HNSCs移植后认知功能显著改善，但对正常成年鼠和记忆未损伤老年鼠的认知功能未有明显影响。 目前在治疗帕金森上已形成一定的理论。如果神经干细胞能够成功地培养并被诱导向某一表型分化，则可以为实验研究和神经移植治疗脑退行性疾病提供丰富的细胞来源。Svendsen等 ［12］ 于1997年从人中枢神经系统成功地分离出神经祖细胞，通过表皮生长因子和成纤维生长因子22的联合诱导后移植入单侧帕金森病的成年鼠模型的患侧纹状体中，2周后即可发现移植区大量未分化的细胞，部分已整合入宿主的纹状 体中。20周后，完全分化的神经元亦位于移植区附近，且部分神经元能表达酪氨酸羟化酶，其程度足以部分减轻动物的运动障碍。该试验第一次表明了人类神经干细胞移植入鼠脑病灶后可分化为神经元并可持续存活20周以上。 4 展望 要实现移植神经干细胞治疗人类中枢神经系统退行性疾病的理想，揭开生物包括人类发育之迷，须把探讨神经干细胞的诱导分化机制作为突破口，更好地利用现代技术提取干细胞在体外培养并结合细胞治疗。Schwann细胞可分泌多种神经营养因子、细胞外基质及细胞粘附因子，我们希望将Schwann细胞与神经干细胞共培养，观察多种营养因子的协同作用。试图把外在因素转变成内在因素，利用海马这一特定区域使神经干细胞按照预想的途径分化成为有特定功能的细胞，然后移植到早老性痴呆的宿主体内与其神经元整合，防止神经元凋亡，改善修复痴呆鼠学习记忆能力，达到治疗目的。0 R2 v1 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发表于 2009-3-3 12:24
发表于 2015-5-23 15:44
