间充质干细胞对异基因鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：殷玉俊,  李晶, 裘影影, 尤海燕, 朱伟, 焦志军作者单位：江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001; 医学技术学院, 江苏镇江212013   \; F- A8 j' `0 o$ a4 V' H

   3 p) R6 H* o! f, u: _
      ! D4 [7 _0 x! h2 J& W  O

         1 b, Z2 A2 G, X9 h) l9 a- S
                  % t; W9 V9 T7 i; o



      5 K7 V% ^  B4 ^8 q" o' s. @; m7 ]

      【摘要】  目的：探讨体外间充质干细胞（MSCs）对BALB/c鼠T,B细胞的免疫调节作用及可能机制。方法：从5～6周龄BALB/c鼠骨髓中分离培养MSCs并鉴定其纯度。用EZ-SepTM Mouse 1X分离异体BALB/c鼠脾脏淋巴细胞，分别在刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）刺激下，用不同比例MSCs处理，MTT法检测淋巴细胞的增殖，流式细胞术检测T,B细胞CD69,CD28和CD86的表达和凋亡，实时定量PCR测定细胞因子IL-10和IFN-γ的mRNA水平。结果： MSCs明显抑制T,B细胞增殖和T细胞的凋亡，促进IFN-γ、抑制IL-10的mRNA表达（P
      【关键词】间充质干细胞；淋巴细胞；免疫调节( i, r2 G  Z  W: C. Y! h
   ［基金项目］江苏省科技厅社会发展基金资助项目（BS2005043）；镇江市科技局社会发展基金资助项目（SH2006024）
( g* H  H& |; J. X
　　　　Immunoregulatory effects of mesenchymal stem cells on　spleniclymphocytes in allogenic mice+ q8 y. ]5 j$ V1 ?3 A

　　YIN Yu-jun,LI Jing, QIU Ying-ying,YOU Hai-yan,ZHU Wei,JIAO Zhi-jun

　　（Department of Dermatology， the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001；School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu212013,China）
& c% s8 m, U: {1 @( W
　　［Abstract］Objective: To investigate the immunoregulatory effects and potential mechanism of mesenchymal stem cells(MSCs) on T and B cells in vitro. Methods： MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of 5～6 weeks old BALB/c mice in vitro. The purity was detected through surface markers by flow cytometry(FCM). Splenic lymphocytes were isolated by using EZ-SepTMMouse 1X. Under ConA or LPS stimulating, lymphocytes were treated with MSCs accorded to different proportion. the proliferation was assessed by MTT coloremetry. FCM was used to analyze the apoptosis and surface markers-CD69，CD28 and CD86. the mRNA expression of cytokines were detected by real-time quantitative PCR.Results： MSCs could inhibit the lymphocytes proliferation and T cells apoptosis significantly with increase interferon-γ but decrease interleukin-10 at mRNA expression,and such effect exhibited MSCs volume dependent. No difference of CD69，CD28 and CD86 expression was observed among three groups. Conclusion： MSCs could down-modulate function of T and B cells,and the potential mechanism maybe related with the effect on the proliferation，apoptosis and the mRNA expression of T cell differentiation-related cytokine.

　　［Key words］mesenchymal stem cells； lymphocytes； immunoregulatory
+ E3 U0 M' v) G
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 是骨髓中不同于造血干细胞的具有多向分化的干细胞，近年来研究表明MSCs不仅在支持造血、器官移植中发挥作用,还发现MSCs对T/B淋巴细胞有显著的免疫负调节作用［1,2］。我们用MSCs干预BALB/c鼠脾淋巴细胞的体外诱导增殖、表面活化标志CD69， CD28和CD86的表达，以及T细胞的凋亡和细胞因子IL-10和IFN-γ的mRNA表达，探讨体外MSCs对BALB/c鼠T，B细胞的免疫调节作用及可能机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物4 M3 r* {- q! M7 |+ `& N) O) ]6 {9 S& B

6 _& l  g  s1 |, A

　　5～6周龄清洁级BALB／c小鼠，共60只。购自扬州大学比较医学动物中心，许可证号：SCXK（苏）2002-0009。

　　1.2试剂与材料# ?1 S" V! }) v! ?4 e

6 i$ u/ j& T/ f8 R% e: m- |

　　刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）和MTT(Sigma公司),DMEM培养粉(Gibco公司), EZ-SepTM Mouse 1X 淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司),大鼠抗小鼠CD3/CD69/CD28/CD19/CD86 和CD29/CD44/CD34/CD45单抗，藻红蛋白(PE)和异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠IgG(FITC-IgG) (eBioscience公司),Trizol (Invitrogen),RT-PCR kit(TaKaRa公司), IL-10,IFN-γ及β-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。- X$ u4 O1 b7 J
7 o, ^: Q& a" c% T' N
　　1.3小鼠骨髓MSCs的制备/ N7 _" R5 S! P" O' b

! Z( h/ k9 T$ Q  q2 l

　　无菌条件下取5～6周龄BALB／c小鼠股骨及胫骨，冲出骨髓制成单细胞悬液。5%的CO2和37℃条件下静止培养，48 h后换液去除非贴壁细胞，以后每3～4 d半量换液1次，细胞达90%融合时传代。取2～3代的MSCs用流式细胞术（FCM）分析CD29( )CD44( )CD34(-)CD45(-)细胞比例大于85%，即得到实验用骨髓MSCs。' n4 m3 J8 Z" W+ ~" X. a

　　1.4脾淋巴细胞的制备

　　无菌取BALB/c小鼠脾脏，在60 mm培养皿中放入4～5 ml EZ-SepTM Mouse 1X 淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。把悬有脾细胞的分离液转移到离心管中，加入适量DMEM培养基，800 g离心30 min。洗涤后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养瓶中贴壁90 min后，悬浮细胞计数。
; l* d0 c* `5 C6 I5 M& A
　　1.5MSCs对T，B细胞增殖反应的影响0 T9 {1 A& T# X. o, Q

　　将2～3代BALB/c小鼠的MSCs制成104/L，105/L和106/ml 3种浓度的细胞悬液，按100 μl/孔加入96孔培养板中，贴壁2 d后直线加速器预处理（15 GY）。脾细胞悬液制成5106/ml浓度，按100 μl/孔加入贴有MSCs的培养板中，用ConA (终浓度为5 μg/ml)或LPS (终浓度为25 μg/ml) 刺激, 实验分组：脾细胞组（对照组），脾细胞 MSCs1组（脾细胞∶MSCs=1∶0.01），脾细胞  MSCs2组（脾细胞∶MSCs =1∶0.02），脾细胞  MSCs3组（脾细胞∶MSCs=1∶0.2），每组复6孔。在37℃ 5％ CO2培养箱中共培养72 h。结束前6 h向各孔加5 mg/ml浓度的MTT 20 μl，培养结束后吸出各孔悬浮细胞，250 g离心10 min，弃上清，每孔加二甲亚砜100 μl，待结晶沉淀全部溶解后，以酶标仪检测波长570 nm的D值。2 A. R8 D$ {9 t1 s6 y/ [0 x

　　1.6MSCs对T，B细胞表面活化标志的影响: H$ z3 S* F* E
* }, a7 n2 {" ~, \( t% {

" K4 b/ `! J+ C+ c# h) w
　　具体方法同“1.5”，培养24 h，每组取1106细胞用FCM进行CD3 CD69 ，CD19 CD69 细胞比例分析。72 h后每组取1106细胞进行CD3 CD28 ，CD19 CD86 细胞比例分析。

　　1.7MSCs对T细胞凋亡的影响

# d! Z& d$ r) v- `9 ~: w& a
　　具体方法同“1.5”, 用ConA (终浓度为5 μg/ml)刺激脾细胞。培养24 h，每组取1105细胞，按Annexin V试剂盒说明书操作，FCM检测凋亡情况。

　　1.8MSCs对IL-10和IFN-γ mRNA表达的影响

; O! W6 t' c6 k0 L
4 c2 v3 {; l7 X" u3 I4 I$ y
　　具体方法同“1.5”,用ConA(终浓度为5 μg/ml)刺激脾细胞,培养72 h收集每组细胞。实时定量PCR检测每组细胞因子的mRNA表达,按试剂盒说明书操作。引物设计如下,β-actin：正义：5′-GTA AAGACCTCTATGCCAACA-3′，反义：5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；IFN-γ：正义：5′-CGGGACACAATGAAGCCT A-3′，反义：5′-GTTGCTGATTATGCCATT-3′；IL-10：正义：5′-GACCAGCTGAAGTGACTA-3′，反义：5′-GATAAGGCTCAACCGTTA-3′。/ u  a6 i  i6 }$ }' X

　　1.9统计学处理

, `) U6 H' H/ I: o& f, \' L

　　数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0统计学软件处理，进行单因素方差分析。P

　　2结果% H6 N4 h& ~' C5 f2 o: Y

0 i0 U: C$ m/ B7 y
0 |- @6 B2 b0 z6 {2 p
　　2.1MSCs对T，B细胞体外诱导增殖反应的影响

$ I; P( d2 i, S, \7 L
　　与脾细胞组相比,各MSCs处理组D值明显降低（P
" n, ^; b# n! @$ E7 \! [

　　表1各组ConA/LPS诱导脾淋巴细胞的D值（略）
  l+ n. x$ F; ^3 B- n
　　Tab 1D value of splenic lymphocytes stimulated by ConA　or LPS in all groups, ~& a& T9 L+ }3 M; n
/ T$ e2 s6 s. _& a) w6 y( S$ V
　　与脾细胞组相比，﹡: P

　　2.2MSCs对T，B细胞表面活化标志的影响
/ f6 c+ G( m6 t. \. z
* P( j6 j0 r7 s" s" r; P5 q
$ j+ F  M" |1 N6 f; U
　　与脾细胞组相比，各 MSCs处理组CD3 CD69 ， CD3 CD28 ，CD19 CD69 ，CD19 CD86 细胞百分率无明显降低（P>0.05），说明MSCs对T，B细胞活化无影响。见表2。

　　2.3MSCs对 T细胞凋亡的影响% E# n* i) v4 W
  |$ M2 [2 Y+ ]& m
; S; u! ^! y/ d5 r
6 i% B/ W; L5 R* s# p; b8 L
　　与脾细胞组的凋亡百分率（28.26±2.14）%相比，各 MSCs处理组的凋亡细胞百分率明显降低（P9 s, t7 q4 K# C2 W& i5 U

　　表2T，B细胞表面活化标志表达百分率（略）( X, }# K7 U& T9 w
, e( M. b4 r# w& n8 t" O
　　Tab 1Percentage of expression of T and B cell surface markers$ ~/ a  G( b1 O) q$ H

　　与脾细胞组相比，﹡: P>0.05

& S6 ~6 z/ O' [/ K
　　图1各组T细胞凋亡百分率(%)（略）0 q4 o) f- t% o

　　Fig 1Percentage of expression of T cell apoptosis in all groups% H# C' C; T& \0 p& t. y  h

　　2.4MSCs对IL-10和IFN-γ mRNA表达的影响
  L# ?" N- `% N2 v

　　与脾细胞组相比，各MSCs处理组的 IFN-γ的mRNA表达明显增加(图2)、IL-10的mRNA表达明显降低（图3）,P
/ w" o1 n& j- \, J6 v5 [
　　3讨论

: c  E) t+ I3 y  {( _' H
　　MSCs虽然具有低或无免疫原性的特点［1］，但MSC对T，B， DC等免疫细胞均有调节作用，在体外能明显抑制PHA等诱导的淋巴细胞增殖。本次实验用ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖，结果表明MSCs能明显抑制T，B细胞的增殖，随MSCs数量增加，抑制作用更加明显。$ P1 Y1 e+ E4 x9 K+ o
3 p/ e0 P+ {& t& o4 W: ]
. k9 {5 p: f/ x9 U& T) S3 s

　　MSCs抑制淋巴细胞的增殖,是否与干预细胞活化有关呢？经FCM分析，MSCs对T，B细胞CD69， CD28和 CD86的表达均无明显影响，这个结果与一些报道相似［2］。CD69， CD28和 CD86是分别活化T，B细胞表面最重要的膜分子之一。CD69可作为一个近期活化T，B细胞群的标志来检测和评估在体内细胞介导免疫的水平［3］。CD28与CD80， CD86互为配体，提供重要的淋巴细胞活化的T细胞协同刺激信号，使T细胞增殖。因此，我们认为MSCs对T，B细胞的免疫负调节可能与细胞活化标志CD69，CD28和 CD86无关。

　　图2各组IFN-γ的mRNA表达（略）
. V. H1 t* E/ j: [/ o
　　Fig 2The mRNA expression of IFN-γ% V3 _8 H' l  R5 g+ ?' W
  r/ q  v5 W/ _, N% t' W  A! r
　　图3各组IL-10的mRNA表达（略）
" |! F5 c" g& \
　　Fig 3The mRNA expression of IL-10

　　细胞的功能与细胞凋亡正常与否密切相关，减少T细胞凋亡，可使Th0向Thl/Th2 细胞分化，影响免疫应答反应,从而导致病情的改善或恶化［4］。我们的研究表明MSCs对T细胞凋亡有明显抑制作用，提示MSCs可能通过凋亡途径来抑制T细胞的免疫功能。已有研究表明，淋巴细胞过度凋亡有可能在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等自身免疫病的发生和发展中起着至关重要的作用［5］。5 G3 j/ R% x; N5 ~; E7 O- C: ~+ W$ c/ Z

$ t6 T8 O4 W/ O, K0 h
　　T细胞亚群的分化与某些细胞因子变化密切相关［6］。研究结果表明MSCs能显著增强IFN-γ mRNA表达，明显抑制IL-10 mRNA表达。此调节作用呈剂量依赖性，随MSCs数量的增加而增强。IFN-γ能诱导Th0向Thl／Tcl转化，IL-10能诱导Th0向Th2／Tc2转化。因此可以推断是MSC诱导了特定的T细胞亚群来发挥免疫抑制作用。骨髓MSCs不表达IFN-γ基因［7］, 可以排除实验中MSC干扰的可能性。董巧凤等［8］用ELASA方法检测了与MSCs共孵育7 d的异体T淋巴细胞的上清，结果显示IFN-γ高表达， IL-10中度表达，这与我们的实验结果相似。分析上述实验结果，我们得出结论，抑制IL-10、促进IFN-γ的mRNA表达，诱导Th0向Thl细胞方向偏移，提示MSCs似乎能有利于抑制Th2细胞占优势的疾病，如系统性红斑狼疮等。" C& {) t- u3 g  l5 I
" U3 p& k, y% C( K* D: Q! n9 \( R

2 A/ U# _5 z" f
　　综上所述， MSCs独特的免疫调节作用，抑制T，B细胞增殖和T细胞的凋亡，干预细胞因子IFN-γ和IL-10的 mRNA表达，有望今后应用于自身免疫性疾病的治疗。, M  T7 A( Q- d4 z
      【参考文献】5 ^! F  s, k" H  b8 Z- b
　　［1］  邓为民，韩  钦，葛  薇，等. 骨髓源间充质干细胞在异基因小鼠免疫器官内的分布及其免疫功能调节作用［J］. 中国免疫学杂志,  20O4， 1（20）：40-45. # {* s. a3 U. ~  O+ D3 ~
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　　［2］  Corcione A, Benvenuto F， Ferretti E, et a1.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions ［J］.Blood, 2006,107（1）：367-372.

　　［3］  Testi R，D′Ambrosio D,De Maria R，et a1.The CD69 receptor：a multipurposes cellsurface trigger for hamatopoitic cell［J］.Immunol Today，1994,15(1):479-483.# X" ]4 _$ ~6 J, i% a5 R

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　　［4］  李  慧，梁  军，侯亚义，等.NZBWF1/J鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群平衡的免疫调节［J］.中华风湿病学杂志，2006， 10（8）：57-46.

- |' Q2 F$ B7 u' T8 q
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　　［5］  Roth R，Nakaruma T，Mamula MJ, et a1.B7 costimulation and autoantigen specificity enable B cells to activate autoreactive T cells［J］.J Immunol，1996，157(7)：2924-2931.+ r0 }/ o! e: C$ P# U5 _
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　　［6］  焦志军，王保龙，路丽明，等. 天花粉蛋白对不同小鼠品系T细胞亚群分化的影响［J］.现代免疫学,2006,26(1)：12-16.

　　［7］  Tse WT，Plendleton JD，Beyer WM, et a1.Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells：implications in transplantation［J］.Transplantation，2003，75（3）：389-397.
9 j. q7 j( u: n8 o3 y' J/ Q
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　　［8］  董巧凤, 贺韦东，尹  哲，等.骨髓间充质干细胞的体外扩增及其对T淋巴细胞产生IFN-γ和lL-10的影响［J］.现代免疫学，2007, 27（2）:140-143.

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