请教做Feeder的问题！

zhaoyan1983

请教每次重新铺Feeder时都需要重新拿出一管MEF解冻吗？
& W' f, C; \* [! i$ }1 o  c3 n然后用第二代做Feeder吗？
: J) x* z* s3 Y* L# n感觉这样做好麻烦，而且很浪费MEF,请问正确的做法应该是什么？请详细说明，谢谢！

shewawa

有文章说feeder年轻的会更好，更容易维持小鼠的干细胞，如果你很喜欢的话。要是没有那么严格的要求的话，MEF可以Passage到第五代，所以在这个过程中你能做出很多feeder之后再用药物或者是放射线使他停止生长，冻存，下次留着用。

haijing12585

回复 1# zhaoyan1983 1 Z) z# t) S. N
这个东西是没有办法改变的！

张也行

刚复苏的细胞一般都会有许多死细胞，所以一般要复苏后培养一段时间后在做饲养层，一方面可以洗去死的细胞，另一方面可以确定你的细胞数量，这样才能确定你复苏的细胞能做多少饲养层。

zhaoyan1983

不是很明白，用丝裂霉素处理过的Feeder还可以再一次冻存吗？8 c3 Z4 a- D) A& e. `& |6 r0 J
但是如楼上所说，复苏后会出现部分死细胞，那么细胞的数目就会出现偏差了吧，/ ]* @9 C+ H( U4 a0 t: x4 [( V
那假如我在冻存之前的一管刚好够铺一个皿的话，那么如果冻存之后死了一部分，那该如何处理啊？

zhaoyan1983

主要是想问是不是每次重新铺Feeder时都需要重新拿出一管MEF解冻？
8 B9 K7 c  V/ O0 \请做过的高手给一个大体的实验步骤！！！！！！！
1 @" ^5 L: |4 q. g7 V& \9 w0 b另外细胞计数是在哪一步啊？

supergama

1、丝裂霉素处理过的MEF可以冻存，但死细胞会有些多，对ES的支持会差点。+ y, L8 S8 e) I+ E- n  c6 ]8 j
2、复苏后直接铺板细胞数量不够可以适当补充，但通常的做法是贴壁过夜后再消化计数铺板。6 U& O; }# G, H- ?, |
所以通常P0-3代细胞冻存，P4-5代处理后用于实验，实验多余的处理过的MEF则冻存。使用时主要根据自己的实验安排来定，较大的实验可复苏早代数如P0，这样MEF与ES可平行培养一段时间。小实验，时间不长可复苏丝裂霉素处理好的MEF用于实验。

张也行

回复 7# supergama
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! m( v, D, m+ z% c, v1 S& s    你说“复苏后直接铺板细胞数量不够可以适当补充”请问怎么补充，直接在feeder少的培养皿中加入适当的MEF就可以了吗？

张也行

回复 6# zhaoyan1983
1 k& [; w2 A+ G/ v6 j* a3 {
, B( w( }0 U6 \, {5 e$ i/ m+ N
    哎 这些东西你在网上找一下就有了。: Y1 `, t" F. W: b; ?
有个网友曾经提供了一个，还行。这个没有太严格了。

supergama

回复 8# 张也行
2 q' t- n8 K$ [: ~7 u) y6 m1 o5 S是的，加适当的MEF就好，关键是要尽量晃匀。