骨髓干细胞治疗急性心肌梗死的进展和问题 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:27 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杨跃进，钱海燕作者单位：100037  中国医学科学院/中国协和医科大学阜外心血管病医院冠心病诊治中心 8 e6 K8 s- m9 D/ r4 n  L

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      【关键词】心肌梗死，急性；骨髓干细胞；治疗1 I' N* F4 o! M3 ~/ o+ B
   冠心病急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后，因大量心肌细胞坏死不能再生，可引发左室重构和扩大，最终导致心力衰竭(heart failure,HF)，已成为危害我国人民生命和健康安全的主要杀手。现有冠脉再通治疗(包括急诊溶栓和介入)虽能挽救缺血心肌，但仍不能补充坏死心肌。心脏移植虽是治疗HF的最佳方法，但因供体来源有限、费用昂贵及移植排斥反应等问题难以满足需要。因此，近年来干细胞移植治疗应运而生且进展迅速，虽然有不少问题有待深入研究，然临床应用前景良好。
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1理论基础1 t/ b: l1 d$ g$ \
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干细胞是一类未分化、能无限或较长期增殖、自我更新，并且在适当条件下能分化为多种功能细胞或组织器官的原始细胞。在人体发育的不同阶段和成年个体的不同组织中均存在着干细胞，但是随着年龄的增长和不同疾病状态的影响，干细胞数量逐渐减少，分化方向也逐步变窄。
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根据分化潜能大小，干细胞可分为三大类：全能干细胞(如胚胎干细胞)、多能干细胞(如造血干细胞)和专/单能干细胞(又称为祖细胞，如内皮前体细胞)。根据发育阶段，干细胞可分为两类：胚胎干细胞和组织干细胞，后者又称成体干细胞，包括神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞等。
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1999年12月美国科学家Jackson等［1］发现小鼠肌肉组织干细胞可以 “横向分化”(transdifferentiation)成血液细胞，进一步研究发现人体多种组织干细胞均可横向分化为肝细胞、肌肉细胞、神经细胞等。提示可以利用患者自身的组织干细胞，诱导分化成病损组织的功能细胞，治疗各种组织损坏性疾病，为再生医学揭开新的篇章。, \; f/ K  ^6 f  E- W: d. |

2实验基础* k1 \. V7 c% c( Z" f$ `8 O2 [. z
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为证实上述理论，Tomita等［2］首次证实大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外经5氮胞苷诱导后分化成有肌管样结构、表达肌钙蛋白和肌球蛋白重链的心肌样细胞；注射至冻伤心肌瘢痕中8周后分化为心肌细胞并促进血管再生。Jackson等［3］对经致死辐射的小鼠移植LacZ转染的骨髓干细胞，移植10周后结扎冠状动脉左前降支60 min制备成MI模型，2～4周时发现梗死区0.02%心肌细胞和1%～2%血管内皮细胞呈LacZ阳性，说明骨髓干细胞能定向迁移至梗死区并分化成心肌细胞和血管内皮细胞。提出干细胞无论是在体外诱导下还是在梗死心肌中，均能横向分化为心肌细胞和血管，为干细胞治疗MI提供了初步实验依据。
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2001年Orlic等［4］将雄性转基因小鼠的Linckit 骨髓干细胞移植入雌性小鼠的梗死心肌周边区，(9±2)d后发现在梗死区新生的细胞中Y染色体阳性的细胞占(54±8)%。同时发现这些细胞表达心肌特异性蛋白，梗死区及周边毛细血管密度显著增加。这一重要发现引发了随后干细胞治疗MI的热潮。初期的动物实验大多显示各种干细胞移植治疗多种类型的HF有效，能增加左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)，阻抑心室重塑过程。在犬、兔和大鼠等动物AMI和HF模型中进行的干细胞移植研究显示，移植细胞不仅能够在心肌中存活和分化，而且左室功能得到显著改善。从而为AMI的干细胞治疗带来了希望。6 q+ W' L, ?$ q+ E& h

3临床研究

Strauer等［5］首开干细胞经冠脉内移植的临床试验，他们选择10例AMI患者，在接受标准治疗同时，于急诊经皮冠状动脉介入术后1周，将骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)移植到梗死相关冠状动脉，随访3个月，移植组较对照组室壁运动障碍的范围减小20%，心肌灌注缺损面积显著减小，LVEF、心脏指数及心输出量均升高。2003年,Perin等报道了利用NOGA系统经心内膜对14例因严重心肌缺血导致CHF的患者心肌内注射自体骨髓干细胞，术后4个月移植组较对照组LVEF增加9%，而左室舒张末容积(enddiastolic volume, EDV)显著减小。这2组小样本临床试验初步提示骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病临床可行。
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Gao等率先在14例顽固性缺血性HF患者进行标准治疗的基础上经冠状动脉移植自体骨髓MNCs，3 d内就有症状减轻，LVEF在1周和3周时分别增加9.2%和10.5%，3个月时EDV减少30.7%，脑钠肽在3 d和7 d时分别减少69.2%和70.4%，7 d时心房利钠肽增加30.1%，PET显示梗死区细胞活力增加10.3%，6个月随访过程中无1例死亡，而对照组心功能无1例出现改善，3个月随访时LVEF减少7.2%，6个月内2例死亡。随后数项临床试验，如TOPCAREAMI等系列研究表明，在AMI患者，经冠状动脉输注自体骨髓或外周血来源的MNCs或内皮前体细胞，能够显著增加LVEF和冠状动脉血流储备、减小EDV和改善冠脉微循环功能。

2004年，作为干细胞移植治疗AMI的第一个随机对照临床试验，BOOST试验［6］结果显示在AMI后4.8 d经过冠状动脉内注射骨髓MNCs，6个月时LVEF增加6.7%，而对照组仅增加0.7%。

2006年德国Schachinger等报道一项多中心、随机对照、双盲临床试验，AMI再灌注后3～7 d分为经冠状动脉移植自体骨髓MNCs(n=101)或安慰剂(n=101)，4个月时移植组LVEF明显增加(5.5%±7.3% vs 3.0%±6.5%，P=0.01)；1年后不仅左室功能改善，而且首次发现干细胞移植可显著减少复合终点事件 (包括死亡、再发心肌梗死和再血管化治疗，P=0.01)。可见，不同类型的成体干细胞应用于不同类型的HF，都有不同程度的心功能改善，也并未出现严重并发症，从不同角度揭示了干细胞移植治疗AMI的广阔前景。+ O1 f+ o, w# ~& b- e8 A8 `- S5 j

4机理及影响因素1 |+ T! W" d1 R7 G, s
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自体干细胞移植治疗AMI的机制现尚未完全明了,目前认为主要有：(1)横向分化成心肌细胞并与宿主心肌细胞形成电—机械耦联，参与心脏局部或整体心功能改善。(2)分化为血管内皮细胞，促进局部毛细血管网新生，增加血液供应，缩小心肌梗死范围，同时促进处于顿抑或冬眠状态的宿主心肌细胞功能恢复。(3)改善心肌间质成分，增加弹力纤维，与分化的心肌细胞共同维持梗死后心室壁的厚度与弹性，阻止心室重塑，限制瘢痕扩展及心室扩张，促进心功能改善。(4)内分泌功能，研究表明移植干细胞在心肌局部微环境中广泛分泌一些细胞因子协同发挥其有益效应。(5)阻止宿主心肌细胞凋亡。此外，干细胞移植的心肌再生获益可能还与宿主自身干细胞动员、缺血区周围心肌细胞增殖、缺血心肌细胞分泌细胞因子有关。
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心肌微环境对于移植干细胞存活率和向心肌细胞分化效率高低，以及能否有效发挥生物学作用起决定性作用。AMI经干细胞移植后，移植干细胞在梗死区会因为缺血/再灌注、炎性因子等恶劣环境的作用而大量死亡。研究表明干细胞移植后在第一个24 h内大多数均死亡，只有15%可能生存到12周。因此如何保护移植干细胞的生存是首要问题，国际上一些研究主要是通过基因转染等方法提高移植干细胞存活。而我们则认为改善局部微环境使之更适合干细胞的生存和作用更重要，且临床可行，是重要的研究方向。3 {% d9 _; M6 \9 T

我们依据中药通心络和降脂药他汀均有类似的“多效性”，设想事先使用这2类药物有可能改善AMI后心肌微环境(“施肥”作用)，对移植骨髓MSCs(“种子”)的存活和分化效果可望产生有益影响。故以猪为模型进行了探索性研究，行AMI造模并即刻心肌内注射自体骨髓MSCs，在移植前3 d～后4 d给予喂服通心络或阿托伐他汀。结果发现，在单纯MSCs移植组，移植细胞存活很少，而通心络和阿托伐他汀显著提高MSCs在梗死心肌中的存活和分化效率，并显著改善心功能和减小灌注缺损面积。这一结果初步表明，通心络和他汀类药物改良“土壤”(损伤的心肌微环境)更利于“种子”(移植干细胞)的存活、分化和发挥效用。开创了提高骨髓干细胞移植效用的新策略和新方向［7，8］。4 {& Z. }  K& U2 q

5存在问题和展望
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干细胞移植治疗AMI的疗效虽在实验和临床研究中较为明确，但是仍然存在下列诸多问题。* ?) ^; r. g# Y- ?& N6 F
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5.1质疑2004年Balsam等［9］和Murry等［10］发表于Nature上的连续2项研究结果显示，骨髓干细胞移植入正常和AMI小鼠心脏中，移植细胞存活很少且在各个检测时点均未表达心肌标志物，而是沿血细胞系分化。Liu等进一步研究显示，在经过不同浓度5氮胞苷处理后，大鼠骨髓MSCs未见任何心肌基因和蛋白表达。Bel等报道，将羊的骨髓MNCs注射入梗死区2个月后，并未改善左室收缩功能和阻止其扩张，结果完全阴性。BOOST临床试验18个月随访结果［11］表明，和对照组相比，AMI患者移植骨髓干细胞后引起的LVEF增加，在18个月时不再显著，认为干细胞移植只是加速了LVEF的恢复速度。
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纵观上述迥然不同的动物实验和临床试验结果可见，目前争议的焦点是骨髓干细胞向心肌细胞横向分化的证据太弱、不足或不一致。因此解决这一问题的关键是找到骨髓干细胞分化成心肌细胞的确凿证据，核心或突破点是在体外和体内均能给出骨髓干细胞能分化成心肌细胞的一致性证据。但这仍是目前国际上科学难题。破解这一难题不仅必要，而且具有极其重要的科学价值、经济和临床应用意义，然迄今仍无突破。
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我们最新研究表明，猪骨髓MSCs在体外培养到一定代数即有部分细胞自发分化为心肌样细胞；经5氮胞苷诱导后，各代MSCs均可分化为心肌样细胞，晚代干细胞诱导后分化的细胞具有更加成熟和典型的心肌细胞结构；而且特别重要的是，在大动物猪的实验中，首次证实骨髓干细胞的横向分化潜能，为干细胞治疗MI亦提供了有力证据。: ?7 B: p! S0 w

5.2移植时机干细胞移植的最佳时机亦倍受关注，因为这对于干细胞的迁移、生存和分化十分重要，然辐，现有相关研究不多，目前认为：) r* C$ Z) g* N: a/ R0 f
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5.2.1早期移植：于AMI后1周内行干细胞移植。此期由于炎性反应强烈，不适宜干细胞存活和发挥作用。Janssens等的研究和REPAIRMI试验表明AMI后24 h移植干细胞未见显著功能学获益。

5.2.2中期移植：指AMI后1周至瘢痕形成前移植。此期间炎性反应逐渐减弱，瘢痕尚未形成，较利于移植细胞的存活和发挥作用。目前的大多数临床试验都选择该时间段进行干细胞移植。  Z; j. V4 y# a8 K, O

5.2.3晚期移植：主要指梗死瘢痕形成后的阶段。此时段移植干细胞，由于瘢痕区缺乏血供，不利于移植细胞的存活；另外由于瘢痕限制了干细胞和宿主心肌细胞的连接，容易形成“细胞岛”而提供心律失常的基质。有鉴于此，目前在该时间段移植干细胞的实验较少。但IACT试验表明在陈旧性MI患者，移植干细胞仍然获益，使得适合干细胞移植的患者人群得以扩展。

5.3安全性另外，干细胞移植的下列安全性问题也令人担忧：
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5.3.1成瘤性：对于成瘤性的考虑主要是针对胚胎干细胞。但是目前尚未在实验条件下发现胚胎干细胞移植后在心脏中形成肿瘤或瘤样组织。也未发现其他成体干细胞在心脏中形成肿瘤。
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5.3.2致心律失常：早期一项研究发现骨骼肌干细胞心肌内注射后导致恶性室性心律失常需要额外安装自动复律除颤器。这是因为移植所形成的骨骼肌细胞，不能和心肌细胞形成电—机械耦联所致。

5.3.3微栓塞： Vulliet等将狗骨髓MSCs经冠脉注射后发现有微梗死形成，首度对干细胞经冠脉移植的安全性提出质疑。但是其他大多动物实验和临床试验均未发现类似情况。- e4 ?3 t. V" y: u; a

5.3.4增加支架内再狭窄发生率：对于移植干细胞引发支架内再狭窄率增加的担心主要来源于以下机制：不适当的介入操作、高剂量GCSF作为动员剂吸引外周血白细胞黏附于支架处内膜、MNCs中含有大量炎性细胞。" N! ^: s9 ^- k% K# O
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总之，干细胞移植治疗AMI的研究已经取得了举世瞩目的进展，随着生物学技术的飞速发展，干细胞移植将被赋予更活跃的生命力。目前干细胞移植治疗研究只要在证据和机制上有所突破，则AMI的治疗将出现革命性的飞跃。  U9 [& F9 R3 Q
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