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作者：杨婷，陈志哲，胡建达，战榕，林艳娟
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【关键词】bcl-2;寡核糖,核酸类,反义;骨髓;造血干细胞
0 H) w7 } ]( K- y6 r2 M 摘要: 目的评价bcl-2反义硫代磷酸寡核酸（ASODN）对骨髓造血功能的影响。方法正常骨髓与含终浓度为10mol/L的bcl-2ASODN共培养12h，以处理后的骨髓细胞为反义组;空白对照组除不加ASODN外处理与反义组相同。分别以2组骨髓细胞建立短期与长期培养体系，动态观察粒、单核系集落形成单位（CFU-GM）的形态和产率;培养结束时，非贴壁细胞以流式细胞仪检测CD34和bcl-2蛋白表达，并观察造血细胞和造血基质的生长态势。结果CFU-GM的形态和产率、CD34 细胞的bcl-2蛋白表达反义组均与空白对照组相近，造血细胞和造血基质的生长态势良好。结论在正常骨髓体外培养条件下，bcl-2ASODN不影响骨髓细胞的造血功能，可能用于白血病骨髓的体外净化。 关键词:bcl-2;寡核糖，核酸类，反义;骨髓;造血干细胞 当前，造血干细胞移植（包括骨髓移植、外周血干细胞移植及脐血干细胞移植）仍是治愈白血病的主要途径。供体的缺乏和严重的移植物抗宿主病（GVHD）很大程度上限制异基因造血干细胞移植的临床应用。自体造血干细胞移植虽然没有上述两种弊端，但移植物中有残留肿瘤细胞，而且这些残留的肿瘤细胞可能已在反复的化疗过程中产生抗药性，常引起移植后复发。研究发现，bcl-2蛋白在淋巴瘤、白血病等血液系统恶性肿瘤细胞中高表达;高表达bcl-2的肿瘤细胞能抵抗化疗药物诱导的细胞凋亡，是化疗后肿瘤细胞残留与耐药的原因之一 ［1-2］ 。因此，从基因水平阻断bcl-2的转录和表达，可能有利于自体造血干细胞移植物的体外净化。笔者所在的课题组曾报道bcl-2反义硫代磷酸寡核酸（ASODN）能显著抑制急性早幼粒细胞白血病细胞株（HL-60）和原代急性白血病细胞的生长 ［3-5］ 。笔者的研究旨在探讨bcl-2A-SODN对骨髓细胞造血功能的影响，评价其在骨髓体外净化中应用的安全性。 1 材料与方法 1.1 细胞及培养体系 正常人骨髓来自福建医科大学附属协和医院门诊志愿者，知情同意后进入本研究。由髂后上棘抽取骨髓，肝素钠（万邦生化医药股份有限公司）抗凝（20U/mL髓血），与IMDM培养液（华美生物工程公司）等倍稀释，用淋巴细胞分离液（相对密度1.077，华美生物工程公司）分离单个核细胞，经IMDM培养液洗涤2次，培养于含10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司）的IMDM培养液，置饱和湿度、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中37℃培养，细胞浓度为2.5×10 6 mL -1 。 1.2 bcl-2ASODN的合成与纯化 bcl-2ASODN序列根据bcl-2基因cDNA（序列号:M13995）设计 ［6］ ，与bcl-2转录起始位点6个密码子互补，且予抗核酸酶硫代修饰，序列为5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3'为bcl-2mRNA开放阅读框架的头12个碱基及其前端的6个碱基，共18mer ［3-5］ 。由392型DNA/RNA合成仪（美国ABI公司）合成，OPC柱纯化，分装冻干后保存于-30℃，实验前用IMDM培养液配制所需浓度，加入培养体系中。: b+ g! V) |# w
1.3 细胞与ASODN共培养分组 1.3.1 空白对照组 正常人骨髓细胞置于T25塑料培养瓶中，以含10黃的IMDM培养液培养12h后，用于集落形成实验及细胞长期培养。 1.3.2 反义组 在正常人骨髓细胞中加入终浓度为10mol/L的ASODN，其余培养条件与1.3.1。" o `8 ?% d+ D7 d; S: K( j! Z
1.4 集落形成实验 采用粒、单核系集落形成单位（CFU-GM）甲基纤维素培养法。培养体系含0.9%甲基纤维素IMDM（华美生物工程公司）溶液，30%胎牛血清，1%牛血清白蛋白（BSA，华美生物工程公司），10 -4 mol/L2-巯基乙醇（Sigma），2mmol/L谷氨酰胺（华美生物工程公司），以及细胞因子―――10ng/mL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、50ng/mL重组人干细胞因子和10ng/mL重组人白细胞介素-3（日本Kirin公司惠赠）。调整反义组及空白对照组细胞数至2.5×10 6 mL -1 ，分别于24孔培养板设3个平行孔，每孔取细胞0.1mL，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 饱和湿度培养箱中培养14d，于倒置显微镜下计数>40个细胞的集落数。各组取平均值。 1.5 细胞长期培养 ［7］长期培养体系由IMDM培养基、10%胎牛血清、10%马血清和5×10 -7 mol/L氢化可的松组成。调整反义组及空白对照组细胞数至6×10 6 mL -1 ，分别于24孔培养板设3个平行孔，每孔1mL，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 饱和湿度培养箱中培养。每7天半量更换新鲜培养基，继续培养，直至12周。锥虫蓝拒染法计数每次更换的培养基中的非贴壁活细胞，调整细胞数至2.5×10 6 mL -1 ，取0.1mL行CFU-GM检测。CFU-GM产率为所测得的CFU-GM百分比×所采集的骨髓细胞总数。采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD34单克隆抗体（BD Pharmingen）及藻红蛋白（PE）标记的bcl-2单克隆抗体（BD Pharmingen）以双染色技术于流式细胞仪检测各组非贴壁细胞中CD34 细胞的bcl-2表达。光镜下动态观察造血细胞和造血基质细胞的生长情况。 1.6 统计学处理 数据以x±s表示，用SPSS11.0软件分析，组间均数比较分别采用配对资料的t检验和几何均数的单因素方差分析。 2 结果 2.1 集落形成实验 反义组CFU-GM形态与空白对照组相似，集落计数值分别为（9.67±2.08）/10 5 个细胞和（12.33±3.21）/10 5 个细胞，差别无统计学意义（P>0.05）（图1）。 A:空白对照组 B:反义组 图1空白对照组和反义组的粒、单核系集落形成单位（×400）（略） 2.2 骨髓细胞长期培养 2.2.1 长期培养CFU-GM的形态和产率 培养至12周，检测非贴壁细胞总数两组均>2.5×10 6 。反 义组CFU-GM形态与空白对照组相似（图2），产率曲线相近（P>0.05）（图3）。 A:空白对照组 B:反义组 图2培养12周空白对照组和反义组的粒、单核系集落形成单位（×400）（略） 图3培养12周空白对照组和反义组的粒、单核系集落形成单位产率曲线（略） 2.2.2 流式细胞仪检测CD34 细胞的bcl-2表达骨髓细胞经过12周长期培养，反义组CD34 细胞的bcl-2蛋白表达阳性率为74.19%，空白对照组为79.56%，二者相近，均达到正常造血所需（图4）。 A:空白对照组 B:反义组 图4培养12周CD34 细胞的bcl-2蛋白表达（略）
+ L7 P7 U+ q& [2 l9 t# P 2.2.3 光镜观察造血细胞和造血基质的生长 在骨髓细胞培养第6～8周时，反义组和空白对照组都可见到纤维母细胞、多角扁平细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等铺满培养瓶，形成融合的贴壁细胞层，在此融合的贴壁层上造血细胞群集成堆，即所谓的“鹅卵石区”（图5）。 A:造血细胞 B:贴壁细胞 图5反义组长期培养体系的造血细胞和贴壁细胞（×400）（略） 3 讨论 高剂量放、化疗联合自体造血干细胞移植是治疗恶性血液系肿瘤和某些实体瘤的有效途径，但是移植物中残存的肿瘤细胞往往导致移植后疾病复发，使治疗失败。因此，体外净化自体造血干细胞移植物是必要的，不同靶基因的反义技术在体外净化中的应用已开始受到研究者的重视 ［8-10］ 。 反义核酸策略是将与癌基因互补的反义核酸（DNA或RNA）导入肿瘤细胞，与靶mRNA结合，阻断相应基因的转录和表达，阻止肿瘤细胞继续生长。笔者采用的是经修饰的ODN―――硫代磷酸寡聚脱氧核酸，它能抵抗核酸酶降解，延长了半衰期且相对容易合成，还可在末端连接脂肪链以增强穿透细胞膜的能力。 有关bcl-2ASODN的研究已较深入。以HL-60为对象的研究提示，一定浓度（5～20mol/L）的bcl-2ASODN能特异性阻断bcl-2mRNA和蛋白的表达，诱导细胞凋亡，提高对化疗药物的敏感性;但可能在一定范围内，随着浓度的增加，其非序列特异性作用（抑制细胞生长）与序列特异性作用一起增强 ［3-4］ 。笔者的研究选取10mol/L的药物浓度，减少ASODN非特异性效应的干扰，结果显示，在此浓度下处理组在集落形成、长期培养CFU-GM的形态和产率、CD34 细胞的bcl-2蛋白表达情况、造血细胞及造血基质生长等方面与对照组均无差异，证明这一浓度是适宜的。 笔者此前曾将正常骨髓细胞和白血病细胞株以1000∶1的比例混合模拟缓解骨髓，将此模拟缓解骨髓与10mol/L的bcl-2ASODN共培养3d，观察到bcl-2mRNA和蛋白的表达水平降低，以及与之相对应的细胞凋亡现象，提示反义核酸的序列特异性作用存在 ［11］ ，证实bcl-2ASODN具备体外净化的基本条件。 CD34 是造血干细胞的特异性表面抗原，正常髓性细胞有适量的bcl-2蛋白表达 ［12-13］ ，而白血病细胞中bcl-2则呈高度表达。笔者采用免疫双标记技术于流式细胞仪检测CD34 /bcl-2的表达，发现反义组和空白对照组差别无统计学意义，也提示bcl-2ASODN对造血干细胞和正常髓性细胞没有特异性作用。研究采用了骨髓短期与长期培养体系，前者通常以CFU-GM为检测手段，而后者则是在长期培养体系中，通过每周检测贴壁层和（或）非贴壁层的CFU-GM、红系集落形成单位（CFU-E）和混合系集落形成单位（CFU-Mix）的产率，连续动态观察骨髓细胞的造血功能，相比之下，后者更适于体外模拟体内骨髓造血功能的实验研究。笔者观察到反义组的CFU-GM的形态和产率与空白对照组相近，而且在长期培养第6～8周时，都可以见到“鹅卵石区”和贴壁细胞层，说明反义组和空白对照组在骨髓细胞体外培养体系中，均可保持造血细胞和造血基质的良好生长态势。 笔者认为，bcl-2ASODN不影响正常骨髓细胞的造血功能，可以安全地应用于体外净化。
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% t6 G2 o2 ^ } （编辑:常志卫） 基金项目: 福建省教育厅科研基金资助项目（K2001075）、福建省卫生厅青年科研基金资助项目（Y2K-1-05） 作者单位: 福建医科大学附属协和医院血液科，福州 350001 |
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发表于 2009-3-3 12:29
发表于 2015-5-23 16:02
