低剂量辐射诱导人骨髓基质干细胞适应性反应的信号传导机制 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：徐晓华  李薇  王冠军作者单位：吉林大学第一医院血液肿瘤科，吉林  长春  130021 # \, `1 W* |! q; T, a7 b; |. N$ I. e

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      【摘要】  　　目的  探讨低剂量辐射（LDR）是否可以诱导人骨髓基质干细胞（MSC）发生适应性反应以及相关的信号传导的机制。方法  选择健康成年人MSC进行培养，待其生长至对数生长期后，将其分成分别假照组、单纯D2和D1对照组及实验组，实验组根据照射剂量和时间间隔不同又继续分成25、75、200 mGy照射4、24、48 h后接受高剂量20 Gy照射共9组。高剂量照射后4 h进行细胞计数、MTT及流式细胞仪检测细胞凋亡，确定细胞发生适应性反应的最佳剂量和时间间隔后，应用75 mGy照射24 h后接受20 Gy照射并免疫印迹法检测pP38MAPK、总P38MAPK、P53、P21蛋白的表达。结果  LDR确实可以诱导MSC发生适应性反应，表现在预先进行LDR后可以使大剂量照射后发生细胞凋亡的百分率下降，且其最佳剂量和时间间隔为D1是75mGy，照射24 h后接受20 Gy照射发生适应性反应最明显，与单纯D2对照组相比，实验组P53、P21蛋白表达明显下降，pP38MAPK表达增加（P＜005）,而总P38MAPK表达无明显变化(P＞005）。结论  LDR可以诱导MSC发生适应性反应，最佳剂量和时间间隔为D1是75 mGy，照射24 h后接受20 Gy照射发生适应性反应最明显，其发生适应性反应是通过P38MAPK途径介导的，并与P53和P21的表达降低有关。
      【关键词】低剂量辐射基质干细胞适应性反应 P38MAPK
   　　大量实验研究和人体观察资料证明,低剂量辐射(LDR)作用于哺乳动物和人体可诱导适应性反应,增强免疫功能,提高抗癌能力〔1〕。LDR诱导适应性反应的机制与DNA修复系统的激活、诱导的基因和蛋白、抗氧化物酶的作用及相关的信号传导通路等有关。近年来有关信号传导途径的研究在LDR诱导的各种生物学效应方面的作用成为研究热点，Shimizu等〔2〕已研究证实了P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）通路介导了由X线诱发的鼠m5S细胞的适应性反应，但这条信号通路是否也同样介导了γ射线诱发的人基质干细胞（MSC）的适应性反应国内外尚无报道。MSC在造血干细胞移植后的造血功能重建方面发挥重要作用〔3〕，能够大量培养MSC以及能够让MSC在体内耐受化疗或者放疗以提高骨髓移植的存活率一直是研究的难点，已有大量研究发现LDR可以诱导很多正常体细胞发生适应性反应，但LDR是否能诱导MSC发生适应性反应及相关机制国内外未见报道。我们应用体外培养的MSC为研究对象观察不同剂量不同时间的LDR对MSC的生物学作用的影响。
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　　1材料与方法' d9 {9 C- _4 J6 h* {) n" }3 x

　　11MSC的分离和培养无菌条件下穿刺采集健康人骨髓5 ml，体外肝素抗凝。采集后6 h内进行离心收集单个核细胞（MNC），DMEM培养液洗涤2次，最后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液培养和传代，选择第3～4代对数生长期MSC细胞（图1）进行实验。. R6 c6 y) Z, }/ Y7 _& ^
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　　12分组及照射条件国产γ射线发生机,工作电压200 KV，LDR(25、75、200 mGy 照射，吸收剂量率125 mGy/min) 4、24、48 h后接受高剂量20 Gy照射(吸收剂量率287 mGy/min)，选择高剂量照射后4 h的细胞进行下述实验，实验设假照组、D2 对照组和D1对照组。0 }) {- X& P* a% ~
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　　13细胞计数将MSC细胞接种到6孔培养板中，细胞数为25103/孔，常规培养,对数生长期时25、75、200 mGy 照射4、24、48 h后接受高剂量照射20 Gy 照射，照射后4 h各取3孔细胞计数,以下实验均采用照射后4 h为观察时间点。6 O) r' M+ a) L- w) {( b* I
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　　14噻唑兰( MTT)比色法检测细胞生长抑制率将96孔培养板随机分为空白组、对照组和照射组,取对数生长期MSC细胞按1103/孔接种于后两组(200 μl)。4 h后换液,使对照组含等量溶剂001 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),照射组应用25、75、200 mGy照射后4、24、48 h后接受高剂量照射20 Gy 照射每个剂量设6个复孔。24 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h后吸出培养液,每孔加DMSO 150 μl,振荡溶解10 min,待结晶完全溶解后,在ELX800酶标仪上选择波长490 nm,空白组调零,测定各孔吸光度A,计算细胞生长抑制率。抑制率=(1-照射组A/对照组A)100%。
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　　15流式细胞仪定量检测细胞凋亡选择未照射组，低剂量照射组，单纯大剂量照射组，低剂量加大剂量照射组，照射后4 h的细胞加入025%胰蛋白酶消化，消化后收集细胞，消化时间不易过长，PBS洗2次，离心1 000 r/min收集1～5106/ml，加入300 μl Binding Buffer悬浮细胞。加入Annexin VFITC 5 μl(工作浓度为10 μg/ml) 和PI 5μl (工作浓度为250 μg/ml)，室温避光15 min。用200目尼龙网再次过滤后,应用美国BectonDikinson公司生产的FACSalibur流式细胞仪,取4 000～10 000个细胞检测，同时选择单纯D1、D2及未经任何处理的细胞做对照。$ d9 V& y' }( l( j9 W; n8 @
1 h( A( D6 n& u# z& m. _+ m
　　16免疫印迹法检测PP38MAPK、总P38MAPK、P53、P21蛋白表达提取高剂量照射后4 h的细胞蛋白，用BCA试剂进行定量，每道上样50 μg，12%SDS聚丙烯酰胺电泳、转膜、封闭。再分别与一抗：兔抗人pP38MAPK、总P38MAPK、P53、P21单克隆抗体(1∶1 000稀释) 4℃孵育过夜，TBST 溶液洗脱5次。再与羊抗兔IgG二抗(1∶2 000稀释) 室温孵育1 h，TBST 溶液洗脱3次后与ECL试剂反应1 min。X光胶片压片曝光20～60 s，以IBAS 图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度，并进行积分处理（以βactin蛋白表达为内参照）。同时选择单纯D1、D2及未经任何处理的细胞做对照。0 b& o! g4 S& Q. C

　　17统计学方法应用SPSS130 统计学软件，计量资料以x±s表示，首先进行方差分析，根据方差分析结果选择应用t或t′检验。) E9 O3 Y8 `8 L! {9 Z/ }; i
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　　2结果# r. e' W, o8 ?$ S5 f

　　21MSC照射后生长曲线的变化见图1。& _  Q! ^0 J& n  o! @( F1 J
7 _1 x2 r" @. O9 ~; G4 Y
　　22MSC照射后生长增殖率的变化见图2。

　　图1MSC照射后生长曲线的变化（略）
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　　不同剂量不同时间间隔细胞增殖率变化
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　　图2MSC照射后生长增殖率的变化（略）5 T- N9 U+ J# n: Q. h* d5 Y

　　23MSC照射后FCM检测细胞凋亡的变化见图3。从左至右依次为正常对照组:凋亡率（包括早期凋亡和晚期凋亡，以下同）129%;75 mGy对照组：凋亡率101%;2 Gy对照组：凋亡率318%；D1 D2组：凋亡率138%。5 {' q$ {- b# h  a: j& b; E
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　　24免疫印迹法检测MSC照射后蛋白的变化见图4。
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　　图3MSC照射后细胞凋亡率变化（略）
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　　图4MSC照射后各蛋白的变化（略）

　　3讨论0 g- P% x2 _8 s0 S2 r7 D- i; }2 E
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　　LDR可以增强细胞对随后大剂量射线所引起的DNA或染色体损伤的抵抗性，即适应性反应〔1，4〕。1984年，Olivieri等人首先报道了“低剂量辐射诱导的适应性反应”。尽管LDR如何诱导适应性反应的机制尚无明确的定论，但归纳起来有以下几个方面〔1，5〕：(1）DNA修复系统的激活；(2）LDR诱导的基因和蛋白；(3）产生抗氧化物酶的作用；(4）信号传导通路介导了再适应性反应；(5）P53蛋白介导适应性反应。近年来有关信号传导途径的研究在LDR诱导的各种生物学效应方面的作用成为研究热点，Shimizu等〔2〕研究了PKC和P38MAPK在培养的小鼠细胞适应性反应中的作用：在X射线照射后立即出现PKCα的激活，PKCα从细胞液转移到细胞膜，低剂量预先照射可以延长这种转位，而非适应性的大剂量射线却可明显下调总PKC水平；低剂量射线还可激活P38MAPK；SB203580为P38MAPK的抑制剂，可以阻止P38MAPK的激活，还可阻止LDR诱导的对染色体异常形成的抵抗性；PKC的抑制剂，calphostin C在这方面具有与SB203580相同的作用；此外，P38MAPK与磷脂酶Cδ（PLCδ）密切相关，后者可以将磷脂酰肌醇二磷酸水解成甘油二酯PKC的激活剂。这些结果表明，PKCαP38MAPKPLCδ所形成的反馈信号回路，共同调节低剂量射线的适应性反应〔6〕。LDR适应性反应现象的研究对象覆盖了细菌、动物及人体细胞，既有正常的细胞，也有肿瘤细胞。有些研究者的实验结果表明，在正常细胞中能诱导出细胞遗传适应性反应，在有肿瘤倾向的细胞中适应性反应不明显，而在肿瘤细胞中却不能诱导出适应性反应。LDR的适应性反应现象比较复杂，它的出现与否可能受多种因素的影响，如不同的肿瘤、不同的个体、不同的组织、不同的细胞生理状态、锻炼习惯、饮食、精神压力等，有的甚至报道与年龄也有关系〔7〕。所以不同细胞也许有不同结果。我们此次以MSC为研究对象，观察LDR是否有诱导其适应性反应的现象，及其相应的信号传导方面的机制。LDR属外源应激性刺激信号，已有研究发现P38MAPK介导外源应激刺激，如紫外线（UV ）、过氧化氢（H2O2）、热休克、缺氧、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1（IL1）、纤维细胞生长因子（FGF）、细菌脂多塘（LPS）和G 细菌细胞壁成分均能将其激活，激活后的P38MAPK可以介导细胞的增殖、凋亡、分化或者迁移等生物学效应。我们研究发现LDR可以诱导MSC发生适应性反应，大剂量照射前经过LDR可以诱导pP38MAPK表达的增加，但是总P38MAPK表达并不增加，同时P53 和P21WAF1表达均下降，这些变化与大剂量照射前未经LDR组比较，差异均具有显著性意义（P＜005）。研究证实细胞经大剂量电离辐射后，细胞周期出现G1﹑G2期阻滞。G1期阻滞可以阻止损伤的DNA进入S期进行复制，这样就避免了新合成的DNA将损伤固定下来；G2期阻滞则阻止细胞在DNA损伤得到修复前进行分裂，可以避免错误的遗传信息进入子代细胞而造成癌变的可能，且p53 基因是通过PKCp38MAPK PLC环路相互作用,激活DNA损伤修复机制诱导低剂量辐射适应性反应发生。P53和P21WAF1蛋白都与G1和/或G2检查点有关，一方面它们表达增强可以避免细胞因外界刺激而癌变，另一方面也促进了细胞凋亡的发生。我们实验发现在预先LDR后的大剂量照射可以降低它们的表达从而提高细胞的存活率而提高适应性反应的发生。另外关于D1和D2的剂量分割问题不同的实验以及不同的细胞会产生不同的结果，刘光伟等〔8〕对EL4 细胞和胸腺细胞的研究认为通常在D1照射后6 h可以诱导D2照射出现适应性反应,D2剂量越小,则适应性反应越早,表现的凋亡保护作用越明显,持续时间越长，当超过25 Gy时,则低剂量(75 mGy)诱导的适应性反应不足以抵御大剂量的损伤作用,适应性反应会消失我们应用75 mGy照射后的2 Gy照射所诱导的适应性反应比较明显，当应用3 Gy照射时则未诱导出适应性反应（数据未列出），这种结果与刘光伟等〔8〕研究结果相一致。同时从实验结果中可以看出，MSC对75 mGy照射后24 h再进行D2照射，与其他剂量和间隔时间比较，其适应性反应最明显。- D7 e0 }$ r8 g1 Q
      【参考文献】
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