脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：周娅蕾，罗二平，申广浩，吴小明，谢康宁，闫志伟作者单位：第四军医大学：1生物医学工程系军队卫生装备与计量学教研室 2口腔医院口腔颌面外科，陕西西安 710033 & l9 s9 ~" p5 B$ ?' [( D6 C0 g


      1 X2 u/ e2 Z, k$ K0 V  N
                     ' Q0 m) o' M: I" a








      4 A) f5 z& x2 i+ ?2 M* L+ I

      【摘要】  目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响. 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色. 结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P
      【关键词】脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞! R1 t4 k" D  U0 Z% X$ n: b! ?
   　　0引言% V/ x: ~0 j* t; Q
* |' n4 i) g' {; ^" ?
　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］. 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］. 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］. 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］. 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响.8 w& c8 N1 L+ U  @& y& s

　　1材料和方法
$ E2 Q- I! |( q0 M! H5 {  M8 q: f- m
　　1.1材料+ O1 r/ p1 J& I! m0 s/ f$ _

　　SD仔鼠，12～15 d，体质量30～35 g，第四军医大学实验动物中心提供. 骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，ZL.0224739.4），治疗频率为15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）.* V" g) v1 x" h

　　1.2方法8 P1 I8 I- N& G% j
7 S5 d2 ?6 j6 w, w+ \
　　1.2.1rMSC的体外分离培养

　　断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨. 在PBS中将骨剪成1～2 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后换液.

　　1.2.2rMSCs生物学特性鉴定5 j, ?" k% W2 W8 v% F  E7 T

　　进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色.% A; X2 d6 @. c( k# @
, G7 k8 D; x: t" Z8 c
　　1.2.3rMSCs生长曲线的绘制/ _( o! V. m3 M) D" @7 [# R, @
: F7 h3 L/ H; c
　　将原代细胞以5106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线. 将第3代细胞以1104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线.
# _) m; k0 T4 {1 l
　　1.2.4刺激方法

　　PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：0～0.8 mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间. 刺激时间为每次3 h，1次/d.1 S& G# s3 c$ G, D  l4 S6 w

　　1.2.5MTT法检测
3 b2 i/ q4 `( i
　　细胞增殖将rMSCs以1104 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔. 刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15 Hz，0.2 mT)；T2组(15 Hz，0.4 mT)；T3组(15 Hz，0.8 mT)；T4组(1 Hz，0.2 mT)；T5组(1 Hz，0.4 mT)；T6组(1 Hz，0.8 mT)，连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用. 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值. 第5日对其余孔做同样检测., y, o  D( P. Z: `4 }+ a5 T

　　1.2.6ALP活性检测
* J! H3 {+ T' d% R6 t* S
　　将rMSCs以每孔1104 cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板. 刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1 Hz，0.4 mT). 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性. 第5日和第15日各检测2个板.
. D, Q9 F2 j; j3 F- K
　　1.2.7四环素荧光标记
$ {, a! X7 d$ Q
　　将rMSCs以3104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间. 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记. 荧光显微镜下观察并采集图像.# ^' ?3 |0 q* o) i+ ?, M& I+ X% `

　　1.2.8钙结节染色
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　　将rMSCs以5104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 接种第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前. 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色. 倒置显微镜下观察并采集图像." w% J: q( h! W; H7 m+ Y) W- ]

　　$ D8 z, d" p, ?4 n! g

　　统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行分析，采用SNKq检验和方差分析. 以P
7 {4 L: o) H" ]  e5 z  g: y
　　2结果
' Y6 x5 _2 a4 q, ~3 o1 K
　　2.1形态学观察及生物学鉴定+ ~) s- o8 N! Z/ Z
9 `. a' c* H1 Y! f
　　接种前3 d可见大量大小不一，圆形悬浮细胞. 第5日大部分细胞呈成纤维细胞样，第7日后，可见梭形细胞，部分形成集落，排列呈规则的辐射状. 经2～3次纯化处理，细胞形态趋于单一化，以梭形、三角形为主，呈集落生长趋势（图1）. 染色结果均为阴性，说明细胞不能分泌糖原、未向脂肪细胞及成骨细胞分化.( q# w" _! P6 m; r5 h: h

　　2.2rMSCs生长曲线的绘制
4 n  I* o' B& D9 H( B+ t9 B
　　细胞生长曲线呈“S”形，具有稳定的潜伏期、对数增长期和平台期. 可见传代细胞生长周期明显比原代细胞短（图2）.9 {/ \- P; F# _4 [7 j4 a

　　2．3PEMFs对rMSCs增殖水平的影响8 }- R$ a9 ~. C$ Y6 w- I2 k

　　PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4与对照组A值分别为0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，组间差异均无统计学意义（P>0.05）. T3，T5和T6组A值分别为0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，与对照组相比差异均具有统计学意义（P' b6 f; \2 z3 l. s6 D+ o
* ]$ |# O8 @0 V8 A/ T
　　2.4ALP活性检测经
  L' Z( N% G5 r. P! o) k* H4 e
　　PEMFs刺激后，实验组与对照组A值3 d为0.225±0.017和0.185±0.025，差异无统计学意义（P>0.05）；5 d为0.348±0.032和0.205±0.026，差异具有统计学意义（P

　　2.5四环素荧光标记
* A+ s4 H' Y7 w# ]; w. u
　　细胞8 d左右呈梭形分布，并出现融合，约16 d左右出现结节状物. 继续培养可见复层生长. 持续培养，中心出现圆形细胞结节. 培养21 d时，尚无明显钙结节出现. 但四环素荧光标记后，镜下细胞周围基质聚集区呈明亮的黄色荧光区，阳性面积约占（10.1±1.2）%；对照组阳性面积约占（2.3±0.7）%. 两者之间差异具有统计学意义（P
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　　2.6钙结节染色结果' c/ s3 o$ o6 Z

　　持续培养32 d后进行钙结节染色，可见钙结节成橘红色，大小、形态各不相同，边界清晰，呈火山状突起，中间有黑色不透光颗粒，周围为橘红色，由中间向周边颜色逐渐变浅，阳性面积约占（15.3±0.6）%；对照组阳性面积约占（9.6±0.8）%. 两者之间有显著差异（P3 \7 t* q& c  ?) B3 w
0 o$ M; h% }& k, N& d0 F- Q
　　3讨论8 }0 t+ b4 S2 D+ g6 Y; Q( g( R& I+ K: P

　　本实验采用全骨髓贴壁法，在冲洗骨髓腔时某些滋养细胞和细胞因子会同时被冲出，与MSCs一同培养，可促使MSCs生长增殖旺盛，活力相对较强. 目前该类方法通常采用的是成年大鼠，虽然成年大鼠可以获得较多的骨髓量，操作也相对方便，但成年大鼠体内MSCs的含量更少，增殖能力也较年幼的动物差，为此，我们采用了12～15 d的大鼠. 根据生长曲线，选取3～4 d的传代细胞用于实验. MTT实验结果显示T5组可以显著提高rMSCs增殖水平，提示该刺激参数可能是PEMFs刺激MSCs生长与增殖的一个“窗口”. 本实验中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4组均未能表现出提高细胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各组细胞增殖水平均有提高，说明对于不同的频率和场强，细胞需要不同的刺激时间，才可以对PEMFs产生有效的反应. 倒置相差显微镜下观察到经PEMFs作用的rMSCs体积明显较对照组大，细胞增殖能力旺盛，传代周期明显缩短，培养2～3 d即可进行传代处理.

　6 V* _! C. h3 R$ W1 C  i

　　PEMFs作用促进成骨细胞增殖、分化，加速了体外骨形成［8］. ALP是成骨细胞的早期标志酶，可标志成骨分化的开始. 有研究发现，MSCs向成骨细胞分化的过程中，ALP水平有时间依赖性，随着诱导时间的延长表达量增加［9］. 本实验结果显示，经过5 d的刺激， rMSCs中可检测到ALP的表达，并随时间延长，表达水平逐渐增高，说明rMSCs向成骨细胞分化，并开始分泌骨基质. PEMFs刺激18 d，四环素荧光标记可观察到相当数量和面积的特征性金黄色，进一步证实rMSCs向成骨细胞分化，并促进了成骨细胞的体外骨形成. 继续刺激，可肉眼观察到圆形或卵圆形的矿化小结，经茜素红染色为阳性，对照组也出现弱阳性反应. 可能的原因是由于培养液或血清的诱导，也可能是由于体外获取的原代细胞含有少量成骨细胞，rMSCs的分离方法还需要进一步改进.( V' U* R* _: b& w( y1 r' w

　　PEMFs有促进rMSCs增殖和成骨分化两方面的作用，是PEMFs有效治疗骨折、骨质疏松等骨科疾病的可能机制之一. 但是将PEMFs用于促进rMSCs增殖以获得大量组织工程种子细胞的时候，需要找到更好的磁场参数和培养条件，控制rMSCs的分化，这些都有待今后进一步深入探讨.- q3 K' P) Y  {. X+ b
0 }4 e# z8 u3 F) @: N) j# V/ {
　
      【参考文献】' ?, a3 i! V3 ]1 d! s! |
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