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作者：张宇坤 杨述华 杨操 孙立 田洪涛作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022 3 u! r. P1 l9 g
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6 h' u4 l7 e6 B5 X3 K& X 【摘要】 ［目的］研究缝隙连接阻断剂1庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体外软骨分化的影响。［方法］体外培养小鼠骨髓基质干细胞（MSCs），贴壁细胞传代，取第3代细胞，以生长分化因子5（GDF5）（100 ng／ml）和1庚醇（2.5 μmol／L）干预培养后，MTT法测定1庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响，RTPCR和免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达，Western blotting检测Cx43蛋白的表达，阿尔辛蓝（Alcian）染色蛋白多糖。［结果］MTT结果显示2.5 μmol／L浓度1庚醇对小鼠MSCs的增殖不产生影响，对细胞没有毒性抑制作用；RTPCR和免疫细胞化学显示1庚醇能够抑制Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达；Alcian染色结果显示1庚醇抑制分化细胞分泌蛋白多糖基质；Western blotting结果表明1庚醇对Cx43蛋白的表达没有作用。［结论］GDF5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化，Cx43蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯在GDF5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用。 8 Z8 h2 D( M% D P1 m- ^
【关键词】GDF－5 软骨 缝隙连接 小鼠 骨髓基质干细胞, J0 m5 M+ F* ^) S' c
Effect of gap junctional blocker 1heptanol on chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro∥
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ZHANG Yukun,YANG Shuhua,YANG Cao,et al.
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$ m5 k. \8 ?! Q, i- z Department of Orthopedics Affiliated to Union Hospital,Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University,Wuhan 430022,China0 \" I9 o( t. X; Y6 O% l! m
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; `8 o0 f( _# r Abstract：［Objective］To investigate the effect of gap junctional blocker 1heptanol on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells with the induction of GDF5 in vitro.［Method］The MSCs were isolated from mouse bone marrow and cultured in vitro.The cells in passage 3 were chosen to induce into chondrogenic differentiation with recombinant human GDF5（100 ng/ml）or 1 heptanol（2.5 μmol/L）.The proliferation effect of 1heptanol on MSCs was investigated by MTT assay.Type Ⅱ collagen mRNA and protein were examined with RTPCR and immunocytochemistry respectively and the sulfate glycosaminoglycan was measured by Alcian blue.Connexin43 protein was examined with western blotting.［Result］MTT assay showed that 1heptanol had no effect on the proliferation of MSCs;RTDCR and immunocytochemistry all showed that 1heptanol could inhibit type Ⅱ collagen mRNA and protein alternatively expressed by MSCs with the intervene of GDF5 and 1 heptanol.Alcian blue staining revealed that 1heptanol could inhibit deposition of typical cartilage extracellular matrix promoted by recombinant GDF5.Western blotting demonstrated that 1 heptanol play no effect on the expression of connexin43.［Conclusion］These results suggest that mouse bone marrow mesencymal stem cells can be differentiated into chondrogenic phonotype with the induction of GDF5 in vitro,and that connexin43conaining gap junction cellular comunication plays an important role in chondrogenesis with the induction of GDF5.: y( M5 S$ A1 e
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Key words：growth differentiation factor 5;gap junction;cartilage;mouse;bone marrow mcsenchymal stem cells.5 p- `( v3 f _4 h
; A: q4 E, S+ }+ ~6 R/ |: v& w# h) V 生长分化因子5（Growth／differentiation factor 5，GDF5）在肢体骨骼发育和关节形成中发挥着很关键的作用〔1〕，在体外也能够促进干细胞向软骨方向的分化〔2〕。GDF5和缝隙连接蛋白Cx43在骨骼发育早期前软骨间充质细胞聚集出现时间和空间上的相似性表达〔3〕，Cx43（Connexin，Cx）介导的细胞间通讯参与了GDF5促进软骨发生的过程。本研究用缝隙连接阻断剂1庚醇阻断GDF5体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨表型的分化作用，进一步研究GDF5在软骨发生过程中与Cx43介导的细胞间通讯之间的关系。2 i2 K$ U1 \* o# S$ s5 k( Q
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1材料
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! ]" h4 B s$ Z7 W% `8 r 低糖DMEM、胰蛋白酶、新生牛血清购自Gibco公司，GDF5因子购自Cytolab公司，小鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体购自Lab Visin公司，Cx43多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，Western Blotting相关试剂、SP免疫组化染色和DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，阿尔辛蓝、地塞米松、胰岛素、VitC购自Sigma公司，RTPCR试剂购自北京天为时代科技有限公司，噻唑蓝（MTT）为华美生物工程公司产品，引物由上海基康生物技术有限公司设计合成。雄性昆明种小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。3 y8 h/ M4 H2 n# M: U
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{( |! E1 x, x6 d" w' c 2.1小鼠骨髓基质干细胞培养! V% ?% ]/ k% Q
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无菌操作下取出小鼠股骨，用含10％新生牛血清的LDMEM反复冲洗骨髓，充分吹打成单细胞悬液，按照1106／cm2密度接种在培养瓶内，37 ℃，5%CO2，100%饱和湿度条件下培养。48 h后首次换液，去掉未贴壁细胞，以后每周换液2次，当细胞接近90％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，按1∶3比例传代。
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! D0 E+ K4 G7 ~0 V: q 2.2体外软骨表型的诱导 j5 J0 l& S8 _. F: M0 e/ V0 ?
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7 C* V3 t* M! k7 [/ W( N 取成长良好的第3代细胞，以1106／ml密度接种于孔底预先铺好细胞玻璃爬片的6孔板上，分3组进行诱导：对照组，培养液为无血清LDMEM；GDF5组：对照组 地塞米松（10-7mol/L）、VitC（50 μg／ml）、胰岛素（6.25 μg／ml）和GDF5（100 ng／ml）；1庚醇组：GDF5组 1庚醇（2.5 μmol／L）。培养板置于37 ℃，5%CO2，100％饱和湿度条件下培养72 h后，取出玻片检测。# g m3 t, I1 c! a0 Y9 q9 J
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2.3MTT法检测1庚醇对细胞增殖的影响- Y" b! l; o# s3 D8 w7 a
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观察细胞培养24、48、72 h后的增殖情况，调整细胞悬液浓度为1105／ml，接种96孔板，加入完全培养基（100 μl／孔）过夜培养。吸掉上清，加入实验组（1庚醇，2.5 μmol/L）和对照组（无血清LDMEM）继续培养，100 μl／孔，3复孔／组。培养20 h每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg／ml），继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μl，30 min后在酶联免疫检测仪OD 570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值。2 f0 h& U" b" t2 `! W2 Z" i
2 d7 j1 ^$ D: @( u# `, x; ] 2.4RTPCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达$ X5 F& g0 v2 _! ^
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6 |+ K S+ o, J+ ]+ n% e 收集培养72 h后的3组细胞，按Triol操作说明提取总RNA，定量后取RNA 2 μg在逆转录酶作用下合成cDNA，然后再以此cDNA为模板行PCR扩增Ⅱ型胶原基因，同时以βactin基因作为内参照。设计Ⅱ型胶原引物序列（上游：5′-AGGGGTACCAGGTTCTCCATC-3′，下游：5′-CTGCTCATCGCCGCGGTCCTA-3′，产物片段为225 bp：）。反应条件:94 ℃ 3 min，（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s）30循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶图像分析系统扫描，Ⅱ型胶原与βactin光密度值的比值进行半定量分析。
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2.5Western blotting检测Cx43蛋白的表达, E: b1 D' Y: P$ j
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3组细胞培养72 h后，用凝胶加样缓冲液裂解法制备细胞总蛋白样品，SDSPAGE电泳及电转移，免疫学检测。利用凝胶图像分析系统分析，检测各条带的光密度值，并与内参照βactin进行比较，计算其比值。
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0 s1 o6 x$ A+ l& v* b 2.6Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色
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取3组细胞爬片，经无水乙醇和丙酮（1∶1）固定处理20 min，PBS洗涤3 min，3%H2O2去离子水37 ℃温育10 min，滴加正常羊血清工作液室温孵育30 min去血清，滴加小鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体（1∶100），4 ℃过夜。加入生物素标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min，加入辣根酶标记链酶卵白素工作液室温孵育20 min。PBS冲洗，DAB显色，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。' c+ ]3 i! {& ^ \, M4 b1 l* E
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2.7阿尔辛蓝染色/ t# j9 j; Z$ w G+ K' _. }
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将3组细胞爬片经无水乙醇和丙酮（1∶1）固定处理后20 min，蒸馏水稍洗后加入1％阿尔辛蓝染色30 min，蒸馏水漂洗至水无色，二甲苯透明，中性树胶封片。
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2.8统计学处理7 z& U/ L/ T" P+ c: g7 d+ o
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( m2 r- }1 h, S2 u 实验数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，P＜0.05表示差异有显著性意义。
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3.11庚醇对MSCs增殖的影响! x. e8 ]' D0 A7 W& s
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不同时间1庚醇对细胞增殖的影响见图1。结果表明24、48、72 h实验组与对照组的平均吸光值相比，差异无显著性意义（P＞0.05）。这说明2.5 μmol/L浓度1庚醇对MSCs细胞增殖不产生影响，对细胞没有毒性抑制作用。
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6 X8 Q I. S1 R, `* s% f 图11庚醇对细胞增殖的影响（略）3 H6 Y6 b& X. J, Q$ h# }: Q
9 s; z& J5 y& b7 h9 }- y0 Q 3.2Ⅱ型胶原mRNA的表达7 ~2 F. o' D( @" {: z5 g
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收集3组细胞经RTPCR扩增后，对照组无Ⅱ型胶原mRNA的表达，GDF5和1庚醇组则均有表达（图2），其与βactin光密度的比值分别为：GOF5组（0.527±0.013）；1庚醇组（0.386±0.008）。GDF5和1庚醇组Ⅱ型胶原mRNA的相对量比差异有显著性意义（P＜0.05），表明1庚醇能抑制GDF5对MSCs向软骨细胞诱导的作用。7 }$ S9 Z8 x+ {& H
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3.3Cx43蛋白的表达4 V- g0 A8 L+ p5 ?7 Y6 b
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Western blotting检测3组细胞培养72 h后Cx43蛋白的表达（图3），相对量分别为：对照组（0.326±0.004）；GDF5组（0.582±0.006）；1庚醇组（0.576±0.014），结果表明GDF5和1庚醇组与对照组相比有显著性差异，而GDF5与1庚醇组差异无显著性意义，说明GDF5能够上调Cx43蛋白的表达，而1庚醇Cx43不产生作用。/ Z/ T! V6 t$ v2 E
( k; r3 P& s9 ? 3.4Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色% e) G8 x2 L) |$ u
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3 k. r8 w5 ?$ L/ ~' _3 F6 A 3组细胞培养72 h后，经SP法染色，对照组染色阴性，GDF5组强阳性，1庚醇组阳性（表1、图4）。这也表明1庚醇能够抑制GDF5诱导MSC向软骨方向的分化。
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4 \3 o+ c& u0 X7 B! ?( x/ O 表13组细胞培养72 h后Ⅱ型胶原染色细胞阳性率比较（略）
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与A组相比：*P＜0.05；B与C组相比：#P＜0.05；A：对照组；B：GDF5组；C：1庚醇组
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- k9 i& ?# V Z# n6 {2 f- D 图2RTPCR检测3组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达（略）
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( e* B* Z2 ?8 S0 }" L& D! h! v M：100 bp DNA Maker6 o9 A( j1 `; R# K
& K! D5 o4 D& v. |* N* ]5 z A:对照组；B：GDF5组；C：1庚醇组
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图3Western blotting检测3组细胞Cx43蛋白的表达（略）
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$ w. l) i; X& e; e$ F6 n A:对照组；B：GDF5组；C：1庚醇组
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$ B3 i0 T3 s9 M3 `: { 图43组细胞培养72 h后Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色（200）（略）8 J% E1 p$ c) d1 n9 ?& W
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4a.对照组；4b.BGF5组；4c.1庚醇组
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3.5阿尔辛蓝染色
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( h3 M) X! E) }6 {6 w& q" s/ D5 I$ Y! L: B- a3 ]
/ e E0 g' s% W1 J# O 对照组阿尔辛蓝染色阴性，GDF5组呈广泛的蓝染，1庚醇组染色较GDF5组明显减弱，但仍成蓝色（图5），结果说明1庚醇能够抑制蛋白多糖的分泌。
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0 w! \: X" E! `: a 图53组细胞培养72 h后阿尔辛蓝染色（200）（略）0 p8 b% _* z$ S$ m0 L( d3 z" g
, E" K5 T) a1 J9 q 5a.GDF5组
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6 G3 b& q( g8 A1 i$ [ 5b.1庚醇组
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4讨论
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软骨内成骨是肢体骨骼形成的主要过程，包括间充质细胞聚集并分化为软骨，随后钙化而形成骨组织〔4〕，GDF5在肢体发育早期间充质细胞聚集和软骨形成方面有着很重要的作用。GDF5自然突变的小鼠表现为bp表型，也称bp小鼠，引起骨骼发育的变化，出现严重的四肢畸形〔5〕：长骨短缩，指（趾）骨扁平并伴有多关节融合，而中轴骨和颅骨则正常。在人类其突变则表现为先天性软骨发育不良的疾病，如HunterThompson型和Grebe型。这种表现主要是由于细胞聚集能力的下降及细胞间不能很好的接触和进行信号的传导所致。体外试验也证明GDF5能够诱导间充质干细胞向软骨细胞方向分化。因此从细胞和分子水平了解GDF5在软骨发生的机理对于研究肢体正常和异常的发育就显得尤为重要。! q- M& g& q+ ?' h# E# g. O
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胚胎骨骼发育过程中，软骨形成最早的形态学变化是间充质细胞间距缩小，细胞与细胞之间形成紧密接触，这是软骨形态发生前的重要过程〔6〕。缝隙连接就是为相邻细胞间特化的细胞膜结构，是一种直接连接细胞的通道，由Cx组成，细胞间信息的传递主要靠缝隙连接来完成。在肢体骨骼发育的早期，缝隙连接蛋白在聚集的间充质干细胞和软骨膜均出现高表达，而Cx43蛋白是主要的表达产物，并且随着细胞分化为软骨细胞其表达也相应的下降。这也表明Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯通过增加细胞间的紧密接触促进细胞间信号的传导和协调，从而在前软骨间充质细胞聚集中发挥着很重要的作用〔7〕。肢体骨骼发育过程中，GDF5和Cx43均在软骨发育过程中早期表达，并且存在很大的关联性，这就表明GDF5在肢体发育软骨内成骨的早期阶段依赖于缝隙连接细胞间通讯，特别是Cx43介导下的细胞间通讯〔3〕。
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缝隙连接细胞间通讯容易受到病理和药物因素的影响，1庚醇是一种脂溶性的缝隙连接脱耦联剂，能可逆性地抑制缝隙连接，但是浓度过大会引起细胞的毒性抑制作用〔8〕。本研究就是采用低浓度1庚醇（2.5 μmol／L）来阻断缝隙连接通讯后观察其对GDF5体外诱导软骨分化的作用。MTT结果证明2.5 μmol/L 1庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖不产生影响，对细胞没有毒性抑制作用，为下一步研究提供了基础。本文用106／ml密度接种培养的小鼠MSCs向软骨细胞方向诱导，无血清培养基设为对照组，GDF5组中加入地塞米松、维生素C、胰岛素和GDF5 100 ng／ml，1庚醇组则在GDF5组基础上再加入1庚醇（2.5 μmol／L），然后通过Alcian Blue染色、RTPCR以及免疫细胞化学等方法，在组织形态学、mRNA和蛋白质水平证实GDF5能够早期诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化，而缝隙连接阻断剂1庚醇则降低细胞分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖基质，这也证明1庚醇通过阻断缝隙连接细胞间通讯而抑制GDF5的软骨分化作用。此外，GDF5能够促进Cx43蛋白的表达，而1庚醇对其上调作用却没有产生影响，这也更加证实GDF5可能通过上调Cx43蛋白的表达来增强缝隙连接细胞间通讯功能，从而促进软骨表型的诱导；1庚醇对Cx43蛋白的表达不产生作用，其抑制软骨诱导的作用主要是通过阻断缝隙连接细胞间通讯来实现的。有研究表明Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯参与BMP家族成员体外诱导软骨细胞的过程〔9〕。本实验结果表明：GDF5作为BMP家族成员，Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯在其体外软骨诱导和体内软骨发生中起着很重要的作用。
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总之，本研究初步探讨了GDF5与Cx43及其介导的缝隙连接细胞间通讯在体外软骨分化过程中的作用及联系，也说明GDF5在体内可以通过Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯来实现对细胞聚集及软骨分化的调控，从而影响骨骼的发育过程。GDF5在骨骼发育和体外诱导软骨表型的机理还没有完全弄清楚，除了与Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯功能的增强有关，细胞内信号Smad和MAP激酶途径也参与了软骨发生过程，相关的机理还需要进一步的研究。) _! ]- {$ N0 U
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△基金项目：国家自然科学基金项目（No.30471753） |
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2015-6-9 09:33
