收蛋白样品为什么粘稠？

hndxws

做western收样时，用RIPA裂解细胞后，蛋白总是很粘稠，听说原因是核酸的原因。不想加太多的RIPA，因为要测浓度，所以不能先煮。请教大家一下，该怎么做才能不粘稠？有人试过加DNA水解酶的吗？

芦苇风

我没用过DNA酶,但我可以说说我的感受。一般来说裂解液都是按细胞/组织量加的，太多了太少了都不好，多了浓度会降低，其中过高的裂解液成分也可能会影响后续的实验；少了会导致裂解不完全。我的感觉是:吸取上清蛋白时，一般是感觉浓稠的用BCA法测浓度较高，反之较低。

hndxws

浓稠的用BCA测的确是偏高的，应该把粘稠的东西使劲吹很多次，变得不是太粘稠了再离心取上清测浓度。主要是吹的太费力费时

芦苇风

我不是太清楚你所说的粘稠的物质形状如何?感觉那些粘稠状的物质离心后是可与上清分离的,经过吹打后又可以减少,两者可以互溶??
5 i- L2 I- |8 }( }# a在最后一次高速离心后,培养后刮取细胞提取物一般分2层,上层清亮,取之测浓度;组织研磨后提取物有时会分3层,中层混浊但不粘稠,最上层清亮,但有时量很少,对于这个我的方法是按组织量追加裂解液再次离心提取上清.
$ K) l8 j4 }% `# v+ QBCA法由于其测定原理,反应后颜色过深或过浅都会使计算结果有偏差.1 S+ ]* W% J! }/ z) d; n8 i( V
我在网上看到的是,如果粘稠物为核酸,可以通过加入DNA酶\增加裂解液的量\裂解前超声裂解细胞将核酸切为小片段.( W! N( d! q, ]$ g/ U+ m
如果想看看粘稠物是什么,可否尝试将其分离后用紫外分光光度法测定下其吸收峰?核酸和蛋白吸收峰不同.然后用加入DNA酶和增加裂解液的方法以比较.可能花点时间,但应该很有帮助.
) Z9 a5 e; }. Y1 e说了很多,好像不沾边,希望能帮助到楼主.

weiyepan

超声打一打最好，有DNase也可以用，不过我没用过RIPA，不知道对Dnase活性有没有影响+ t! ?' S" o  S0 k