腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转移促进人间充质干细胞成骨化 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：孙志波，  杨述华，  禹志宏，  王家宁邹海兵，  张  磊作者单位：（1华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北武汉  430000；





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      【摘要】  目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（BMP2）基因转移对人间充质干细胞（hMSCs）成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养hMSCs，体外扩增纯化后随机分为4组。(1)AdBMP2组：培养液中加入BMP2基因重组腺病毒（AdBMP2，1×1010OPU/mL）孵育24 h；(2)AdLacZ组：培养液中加入半乳糖酐酶基因重组腺病毒（AdLacZ）；(3)阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β甘油磷酸钠。(4)空白对照组。2 w后行Von Kossa染色检测hMSCs中骨胶原结节形成；生化分析仪检测碱性磷酸酶（ALP）活性。结果:经多次换液传代，hMSCs呈均一梭形。AdBMP2组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少，Von Kossa染可见大量红色骨胶原结节形成，ALP活性也显著增高。结论:AdBMP2基因转染对hMSCs成骨能力具有促进作用。
      【关键词】间充质干细胞；骨形态发生蛋白；腺病毒；基因转移；骨生成* y" F2 q; q" f7 I
   Adenovirus Mediated Bone Morphogenetic Protein 2 Gene Transfer Promotes Human Osteogenesis of Mesenchymal Stem CellsSUN Zhibo1,2,YANG Shuhua1,YU Zhihong2*,WANG Jianing3,ZOU Haibing2,ZHANG Lei2(1Department of Orthopaedics,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong Science and Technology University,Wuhan,Hubei 430000;2Department of Traumatic Orthopaedics;3Institute of Clinical Medical,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

Abstract：Objective To investigate the effect of adenovirus mediated bone morphogenetic protein 2 (AdBMP2) gene transfer on human osteogenesis of mesenchymal stem cells (hMSCs).Methods hMSCs were isolated from healthy volunteers,cultured and purified in vitro,and randomly divided into 4 groups.In AdBMP2 group,BMP2 recombinant adenovirus (AdBMP2) was added into culture medium(11010OPU/mL) and incubated for 24 h.In AdLacZ group,AdLacZ was used with the same protocol as AdBMP2 group.In positive control group,dexamethasone (1nmol/L),glycerophosphate (10 mmol/L) and ascorbic acid (50 mg/L) were added into culture medium for 2 weeks.In blank control group,no special treatment was given.Two weeks after treatment,calcified nodes of hMSCs were tested by Von Kossa staining and alkaline phosphatase (ALP) in culture medium was detected.Results hMSCs were uniform spindleshaped fibroblast after several passages.After treatment,hMSCs in AdBMP2 group and in positive control group gradually showed flat shape.Von Kossa staining demonstrated that red bone collagen nodes of hMSCs in AdBMP2 group and positive control group were significantly more than in AdLacZ and blank control group.ALP in culture medium in AdBMP2 group and in positive control group were significantly higher than in AdLacZ group and blank control group.Conclusion Adenovirus mediated BMP2 gene transfer may promote osteogenesis of hMSCs．8 J+ n6 P# I# }4 E- G9 m

Key words:Mesenchymal stem cells;Bone morphogenetic protein 2;Adenovirus;Gene transfer;Osteogenesis
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人间充质干细胞（human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs）是一类主要存在于骨髓的中胚层来源的成体干细胞[1]，具有很强的成骨分化能力[2]，hMSCs很容易携带外源目的基因，是基因治疗的良好载体[4]。骨形态发生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2）是目前国内外研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白家族成员之一，可诱导多能干细胞分化成为成骨或成软骨细胞，为骨缺损等难治性骨疾病治疗带来希望[3]。有实验证实将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成[5]，也可将整合有BMP2基因的腺病毒载体体外转染骨髓基质细胞后植入体内用于治疗骨缺损[6]。通过细菌内同源重组技术构建BMP2基因重组复制缺陷性腺病毒（AdBMP2），可高效感染hMSCs，使之大量表达。然而AdBMP2是否对hMSCs的成骨能力产生影响，目前报道较少。本研究通过观察腺病毒介导BMP2基因转染后hMSCs成骨能力的变化，以探索转染BMP2的hMSCs移植治疗骨疾病的可行性。, k8 U0 o9 d% s+ s! U  p5 g* o

1材料与方法
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1.1材料

人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者,新生牛血清(杭州四季青生物有限公司),高糖DMEM(美国Gibco公司)；FITC标记鼠抗人CD34和SH2单克隆抗体购自美国Neumarker公司。AdBMP2和AdLacZ均由本院研究所构建，王家宁博士惠赠。; V( @1 A$ A( E% e4 b& l( k

1.2方法
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1.2.1hMSCs分离培养及鉴定:采用全骨髓法。髂前上棘抽取新鲜骨髓10 mL，肝素抗凝。加入无血清DMEM，洗涤1次，用含15%新生牛血清DMEM培养液，按1109/mL接种于一次性塑料培养瓶中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后换液，去除大部分未贴壁细胞，此后每3～4 d换液1次，细胞70%融合时1∶3传代。取P2代细胞，重新悬浮成1106/mL单细胞悬液，加入1∶200稀释FITC标记的鼠抗人CD34和SH2单克隆抗体，避光孵育20 min，上样流式细胞仪检测细胞表面CD34和SH2。
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1.2.2实验分组及处理:取上述50%融合P2代hMSCs，随机分为4组。（1）AdBMP2组：在细胞培养液中，按11010OPU/mL加AdBMP2，孵育24 h后换为普通完全培养液，继续培养;（2）AdLacZ组：用半乳糖苷酶（LacZ）基因重组复制缺陷性腺病毒（AdLacZ）取代AdBMP2，余处理同AdBMP2组;（3）阳性对照组：培养液中添加地塞米松（1 nmol/L）、抗坏血酸（50 mg/L）和β甘油磷酸钠（10 mmol/L），3～4 d换条件培养液1次;（4）空白对照组：不进行特殊处理。1 k/ R* j0 F( Y5 z5 k7 O& F* F
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1.2.3碱性磷酸酶ALP活性:第12 d，各组部分细胞换液为无血清DMEM培养液，48 h后收集培养上清液，上样全自动生化分析仪检测ALP活性。. x$ W. H8 {' W) T. ?1 q& c
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1.2.4Von Kossa染色:第14 d，取各组细胞，吸弃培养液，PBS冲洗2次；10％甲醛固定20 min；双蒸水漂洗2次，自然凉干；每孔加入新配制的1.5％硝酸银溶液1 mL，暗室避光10 min；吸干，去离子水冲洗2次，双蒸水覆盖细胞表面，紫外线下暴露，肉眼及显微镜下观测黑色结节；去离子水清洗，5％的硫代硫酸钠浸泡2 min；充分水洗后中性红复染，显微镜下观测红色骨胶原组织。

1.3统计学分析& Z4 R" w6 h( j' c+ x6 Y- ^8 O
) W2 T, b7 U7 t, i
统计分析软件SPSS 13.0计算，所有资料用均数±标准差（x±s）表示，单因素方差分析比较各组培养上清ALP结果，组间采用两样本均数t检验，P＜0.05为显著性差异。$ z( R; h( U  I3 j6 p$ `7 o) e6 y7 Y* w
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2结果

2.1hMSCs分离培养及鉴定

全骨髓接种后，可见少量贴壁梭形细胞和大量悬浮造血细胞。经34次换液，悬浮细胞基本除尽。经过34 d潜伏期后，贴壁细胞增殖加快，呈集落方式生长，并相互融合。7～9 d达到70%融合，进入传代培养。传代细胞仍呈梭形，形态均一，呈集落样生长，增殖迅速，集落中央细胞呈多层重叠，边缘细胞以螺旋方式生长排列并与相邻集落融合。一般4～5 d达到70%融合，可再次传代。经流式细胞仪检测，（85.23±10.11）%细胞CD34阴性，（91.21±10.53）%细胞SH2阳性，符合hMSCs特征。) Z" O& N4 |/ o
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AdBMP2组hMSCs处理后，细胞逐渐转变为多边形或不规则形，突起减少，同时增殖趋缓，集落生成不明显，一般6～7 d铺满瓶底。阳性对照组hMSCs变化相似。AdLacZ组与空白对照组hMSCs形态与处理前无明显变化。细胞呈梭形，以集落方式生长，圆环状融合。6～7 d后达到80%融合。* m7 ~& S! K+ g' P' G
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2.2ALP活性检测
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AdBMP2组（7.28±0.58 u/L）与阳性对照组(7.51±0.47 u/L）ALP活性显著高于AdLacZ组(2.34±0.59 u/L）和空白对照组(2.10±0.63 u/L)(P＜0.05)。
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2.3Von Kossa染色% N6 {$ \; V! o: }; I
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经Von Kossa染色，AdBMP2组和阳性对照组形成骨胶原（红色，图1～2），明显多于AdLacZ组与空白对照组（图3～4）。

3讨论6 `2 W/ C0 w5 T  Y) z* u3 C7 `
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由于骨髓间充质干细胞具有多向分化性的特点，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，所以骨髓间充质干细胞的定向诱导具有重要的作用。大量研究表明骨髓间充质干细胞在向成骨细胞分化的过成中有多种细胞因子参与其分化调节，其中地塞米松、甘油磷酸钠和维生素C对hMSCs的体外成骨诱导作用已得到肯定[7]。骨形态发生蛋白2是一种新型骨生长因子,它已被公认为是目前最强的骨诱导因子[8]，在骨组织修复过程中，BMP2通过自分泌和旁分泌在细胞及细胞间质之间传导信息，调节细胞的分泌和增生，在骨折愈合中发挥着重要作用。
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基因治疗包括基因转移和基因转染，腺病毒是目前常用的基因转染载体，转染效率接近100%。腺病毒介导的目的基因并不整合到染色体中，只在胞浆中表达，表达时间通常持续4～8周，既可以满足基因治疗的时效要求，又可以保证其安全性[9]。本实验采用基因转染方式将细胞体外培养后转染BMP2基因形成AdBMP2，通过腺病毒成功实现BMP2基因转染hMSCs并促进其成骨。结果发现细胞不仅在形态和生长方式上趋向成骨细胞，同时ALP表达增加，钙结节和骨胶原形成。经与AdLacZ组比较，发现同种腺病毒介导的LacZ基因转染对hMSCs无类似促进成骨作用，说明AdBMP2对hMSCs的促成骨作用是BMP2基因表达的结果，而不是腺病毒的作用。6 @' H( J: p4 Y5 S( l# k6 x. s+ ]
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高ALP是培养条件下成骨细胞的特征之一，其主要作用是由成骨细胞分泌到周围基质中，分解磷酸钙盐，使局部的磷脂和游离钙离子浓度增高；磷脂与钙离子有很强的亲和力，结合后沉积于类骨质，导致其迅速钙化成骨,因此ALP对于成骨细胞发挥成骨作用有重要意义[10]。本研究在ALP检测之前换液为无血清培养，旨在消除血清中ALP对结果的干扰。矿化结节和骨胶原则是成骨细胞最可靠的证据，AdBMP2组和阳性对照组引起的细胞ALP活性的增高和矿化结节及骨胶原形成，有力地证明了它们具有促进MSCs成骨的作用。# Q$ a9 q# L3 r! D
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本研究验证了转染BMP2基因的hMSCs移植治疗骨组织缺损、骨折不愈合等疾病具有一定的可行性。除成骨外，hMSCs还可能分化为脂肪、软骨、肌组织甚至肿瘤，因此在移植前对hMSCs进行成骨诱导非常必要。传统的方法是给予地塞米松抗坏血酸 β甘油磷酸钠联合诱导。本研究发现，AdBMP2组hMSCs的成骨能力与阳性对照组类似，但阳性对照组的诱导时间长达2周，AdBMP2组处理时间只有24 h，说明BMP2可以显著缩短成骨诱导时间。如应用于临床，则可显著缩短治疗周期，降低细胞污染，具有一定的研究和应用前景，但目前转染BMP2基因的hMSCs移植是否能够达到治疗骨不连、骨缺损的临床预期效果则有待更多的临床资料证实。
      【参考文献】
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