诱导分化的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：韦多，王彦，高选，沈芸，徐凯，赵跃然，赵力新，陈子江作者单位：（山东大学附属省立医院生殖医学中心，济南 250021） $ O( V1 k) j- y8 i' Z; I6 j* [


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      【摘要】  目的  探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB）阶段，直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法  采用阶段诱导的方法，首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化，通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上，撤除丝裂原，加入5%胎牛血清，观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞，并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果  经选择培养基培养3?d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞，nestin呈阳性。加入血清进一步诱导，可分化出βⅢtubline阳性的神经细胞。结论  小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段，可直接诱导分化为神经细胞，并且前期可得到大量的神经前体细胞。 6 r; P3 h: @( Y& }+ u
      【关键词】孤雌生殖；胚胎干细胞；诱导分化；神经前体细胞；神经元
   neural cells without embryonic body culture in vitro

WEI Duo, WANG Yan, GAO Xuan, SHEN Yun, XU Kai, ZHAO Yueran, ZHAO Lixin, CHEN Zijiang
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（Center for Reproductive Medicine， Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China）
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To investigate the feasibility of direct differentiation of mouse parthenogenetic stem cells into neural cells without embryonic body culture in vitro. MethodsThe method of phase induction was used to induce direct differentiation from parthenogenetic stem cells to neural precursors which were identified by nestin immunofluorescence staining. Sequential culture was applied for the further differentiation into neural cells with the removal of mitogen and addition of 5% fetal bovine serum. The characteristics of the further induced cells were identified by immunofluorescence staining. ResultsLarge amounts of parthenogenetic stem cells were differentiated into neural precursors, which were nestinpositive in the selected medium on the 3rd day. Also βⅢtublinepositive neural cells could be induced from the neural precursors by further culture. ConclusionMouse parthenogenetic stem cells could be directly differentiated into neural cells without embryonic body culture in vitro and induce large amounts of neural precursors.3 ?2 {2 H( z( J0 j- u& v5 T$ q' G- O

Key words： Parthenogenesis; Embryonic stem cells; Inducing differentiation; Neural precursor; Neurons孤雌激活是指没有雄性配子参与，运用物理和化学方法，体外刺激MⅡ期的卵母细胞，致使其形成原核，发育成胚胎。分离源自孤雌激活的卵母细胞并发育至囊胚阶段的内细胞团（inner cell mass, ICM），建立起来的干细胞称为孤雌胚胎干细胞［1］。尽管利用这种方法已经在哺乳动物（鼠）、灵长类（猴子）以及最近在人类建立了孤雌胚胎干细胞系［24］，但其技术难度大，相关的研究报告较少。孤雌胚胎干细胞与胚胎干细胞一样，具有自我更新与多向分化潜能，是治疗神经系统疾病重要的种子来源［5］。由胚胎干细胞诱导分化的神经细胞或其前体细胞移植已经成为治疗神经系统疾病的热点。在实际应用中，孤雌胚胎干细胞不仅可以避免由于破坏胚胎而引起的伦理问题，而且由于其为单性来源，在组织器官移植中可以减少免疫排斥反应的发生［67］。目前，对孤雌胚胎干细胞诱导分化的各项实验研究，均需通过拟胚体培养阶段。本实验旨在探讨不经过拟胚体阶段，直接将孤雌胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的可行性及效果。

1材料与方法
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1.1材料昆明小鼠品系孤雌胚胎干细胞株mPGES由山东大学省立医院干细胞研究中心自建。KnockoutDMEM、1:1DMEM/F12、胎牛血清、血清替代物、谷氨酰胺、非必须氨基酸、β巯基乙醇、50B27因子、100N2因子均为Gibco公司产品。碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF）、重组人白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、人血浆纤连蛋白均为Chemicon公司产品。表皮生长因子（epidermal grouth factor,EGF）为Sigma公司产品。Nestin单克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗微管蛋白（βⅢtubline）均为Chemicon公司产品。山羊抗兔异硫氰酸荧光素IgG抗体、山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素IgG抗体系武汉博士德公司产品。: }4 M, p; a4 u

1.2方法6 u$ ~$ n9 q: Q
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1.2.1mPGES细胞培养mPGES为昆明品系小鼠卵子在体外经化学激活后分裂至囊胚阶段,取其内细胞团建系所得的细胞株。mPGES培养液由KnockoutDMEM、10%胎牛血清、10%血清替代物、2?mmol/L谷氨酰胺、0.1?mmol/L非必须氨基酸、0.55?mmol/L β巯基乙醇、4?ng/mL bFGF、0.01?μg/mL LIF组成。培养5～6?d后，用0.05%胰蛋白酶消化细胞克隆。在显微镜下观察消化情况，加入mPGES培养液终止消化。然后将消化成单细胞的mPGES按1∶3比例传代，接种于预先制备的饲养层上，在37?℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每天观察、记录mPGES生长情况。, F# t, W1 a; H0 B/ @
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1.2.2定向诱导mPGES分化为神经前体细胞取生长旺盛的mPGES消化为单细胞悬液。加入mPGES培养液后转入预先用明胶处理过的培养皿中，放回培养箱静置培养30～45?min，去除贴壁生长的饲养层细胞。收集未贴壁的mPGES，将细胞以适当的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的四孔板上，待第2?d细胞贴壁后换成神经前体诱导培养基1∶1DMEM/F12,50B27、100N2、 5?mg/mL人血浆纤连蛋白、20?ng/mL EGF、20?ng/mLbFGF，每天换液。贴壁后的细胞每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，取贴壁第3?d的细胞进行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学鉴定，以确认神经前体细胞。
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1.2.3神经前体细胞的进一步分化经nestin鉴定后的神经前体细胞，在培养基中撤除丝裂原bFGF及EGF，加入5％胎牛血清促进细胞的进一步分化。对分化的细胞进行形态学的观察，待出现神经上皮样细胞时用GFAP，βⅢtubline进行鉴定。
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1.2.4免疫细胞化学检测神经前体细胞取贴壁3d的细胞，4%多聚甲醛固定10?min，0.2%TritonX100处理10?min,正常山羊血清室温封闭20?min，滴加一抗兔抗nestin（1∶100） 4?℃过夜，滴加二抗山羊抗兔异硫氰酸荧光素（FITC 1∶50）37?℃孵育1?h，DAPI染核。漂洗后滴入抗荧光淬灭剂后荧光显微镜观察，拍照。实验设置空白对照组，以PBS代替一抗。$ B! n' J# Z* t

1.2.5神经前体细胞分化结果的检测培养基中撤除丝裂原bFGF和EGF,加入5%胎牛血清，每日换液。取分化10?d的细胞用4％的多聚甲醛固定。分别做GFAP,βⅢtubline免疫细胞化学染色，步骤同前。& S! D4 T# l! I' j3 ]
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2结果6 n5 [( w" o+ v& s
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2.1mPGES生长培养结果经常规消化，传代于饲养层上的mPGES细胞在3?d后可见到细胞小克隆出现（图1A）。继续培养5～6?d，光镜下可见孤雌胚胎干细胞集落表面光滑，结构致密，隆起生长，克隆细胞间界限不清楚，呈岛屿状（图1B）。* f) X) }. ]' p4 o6 \1 H+ n% @$ \
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2.2神经前体细胞的诱导分化结果诱导分化第１?d,细胞贴壁良好，细胞呈多边形。换为无血清的神经前体诱导培养基，3?d后若干细胞死亡，存活的细胞呈小圆形，枣核状，多有两个突起（图2 A,B），在形态学上具有神经前体细胞特征。经nestin鉴定，绝大部分细胞呈nestin阳性（图2C）。图2孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化
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2.3神经前体细胞进一步诱导分化结果细胞诱导分化具有神经前体的细胞形态后，从培养基中撤除bFGF和EGF，加入5％胎牛血清后继续培养，每日镜下观察细胞形态。大约培养10?d后，可观察到有神经上皮样细胞存活。经GFAP，βⅢtubline鉴定，前者为阴性，后者为阳性。说明存活细胞为早期神经元细胞而不是胶质细胞。阳性细胞形态多样，可见细长形、不规则性和三角形（图3）。图3分化形成不同形态的神经元样细胞（βⅢtubline免疫荧光染色400）

3讨论3 a: F7 s1 j+ ^) D& ~3 k
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所谓孤雌生殖是指在无需精子的条件下，运用物理和化学的方法，体外刺激MⅡ期的卵母细胞，致使其形成原核，发育成胚胎，并可逐步发育至成熟而产生后代。孤雌生殖在许多动物中均有体现：如昆虫类的蟑螂、苍蝇、蚂蚁、蜜蜂；脊椎动物类的蜥蜴、蛇、鱼、鸟类及两栖动物等。孤雌来源的胚胎干细胞与普通的胚胎干细胞一样,具有自我更新能力和多向分化潜能。本实验室所建mPGES细胞株经微卫星技术检测表明为孤雌来源，碱性磷酸酶呈阳性表达，表面标志物Oct4、阶段特异性胚胎抗原（stagespecific embryonic antigen，SSEA）1呈阳性，SSEA4阴性。表现正常二倍体核型，将mPGES接种于重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency,SCID）小鼠皮下8周后，出现肿块，病理切片观察可见三个胚层的组织,以上资料表明该细胞株具有胚胎干细胞特性。" E7 G. b6 s+ n$ H, q+ O
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哺乳动物孤雌胚胎来源的干细胞由于缺乏了父源性印记基因，其分化能力较正常受精卵来源的胚胎干细胞差［8］。目前，对于孤雌胚胎干细胞向三个胚层分化的能力看法不一。Newman等［9］发现,来自鼠孤雌胚胎的ICM在增殖和分化方面存在缺陷。由于缺乏胰岛素样生长因子1受体（IGF1r）和胰岛素样生长因子2（IGF2）的基因表达产物，源自孤雌胚胎的ICM（inner cell mess）不能保持未分化的干细胞状态，且几乎分化为独有的体壁内胚层细胞。另有资料显示：孤雌胚胎干细胞的分化潜能主要是在向内胚层和中胚层分化时受到限制［8］。本实验mPGES的体内分化结果显示，畸胎瘤外胚层组织所占比例最大；在体外的诱导分化实验中，也可以在短期内诱导出大量的神经前体细胞，实验结果表明孤雌胚胎干细胞的优势分化为外胚层。' g) r, C  ?' {
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目前，孤雌胚胎干细胞定向诱导分化的研究都借鉴了胚胎干细胞(ES)的诱导方法。ES诱导神经分化的方法中，多数是先获得多分化潜能的神经前体细胞，进而再分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等三个神经谱系［1011］，整个分化过程ES经历了ES类胚体-神经前体细胞-终末细胞4个步骤。实验中EB培养需悬浮或悬滴3～5天，在此期间营养成分的欠缺或EB悬浮不充分均会导致EB结构松散，活力降低，将严重影响ES的进一步分化。不经过EB培养阶段，直接将细胞分阶段进行诱导分化，细胞虽未形成三维立体结构，但是相邻细胞之间仍然可以通过二维空间内的相互接触产生联系［12］。EB细胞团内细胞之间互相诱导，可导致细胞的异质性分化，不利于ES向单一神经前体细胞的诱导［13］。
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实验表明，不经EB培养阶段，直接将mPGES诱导分化为神经细胞前体的过程中合适的接种密度对诱导结果至关重要。接种密度太低，会影响细胞间各种内源性信号的相互作用，使得分化的细胞明显减少。接种密度过高，细胞密集，接触抑制作用增强，容易导致细胞停滞分化死亡。本实验结果显示，在用四孔板接种mPGES时，每孔密度约为2104个细胞，将细胞均匀接种在四孔板中，以贴壁后细胞相邻不叠加能观察到单个细胞形态的密度为宜。

ES向神经细胞分化的过程与细胞的内环境、神经营养因子、分化因子和信号转导有关［14］。B27中含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠等神经细胞生长必须的因子，可能对神经前体细胞的存活和分裂生长起到重要的允许作用。在培养基中添加纤维连接蛋白可以增加存活的前体细胞数量。资料表明［15］，EGF和bFGF均可以维持神经干细胞的自我更新能力。bFGF在神经干细胞增殖的早期发挥促有丝分裂作用，使神经干细胞获得对另一作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性，液中撤除丝裂原后，EGF反应性干细胞绝大多数分化为胶质细胞，而bFGF反应性干细胞则向神经元表形祖细胞分化。此外，胚胎发育过程中，bFGF反应性干细胞的出现早于EGF反应性干细胞，而神经元发育恰恰早于胶质细胞发生。这与本实验对诱导所得的神经前体细胞进一步诱导分化后，鉴定所得细胞为早期神经元细胞而不是胶质细胞的结论相一致。
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目前，人们将神经干细胞表达的中间丝蛋白家族成员nestin作为神经干细胞的特异性生化标记。免疫荧光鉴定证实，几乎所有的神经干细胞均呈nestin阳性。然而神经干细胞生存的微环境可以影响其形态和生化特征，所以神经干细胞的进一步鉴定必须由其本质特征—自我更新和多向分化潜能决定。本实验在鉴定出nestin阳性细胞后，撤除丝裂原，加入血清进一步诱导分化，所得细胞为βⅢtubline阳性的早期神经元细胞，进一步证明mPGES直接诱导分化所得的nestin阳性细胞为神经前体细胞。% y5 b- p4 b6 j) Q

孤雌胚胎干细胞作为获取自身组织的一种细胞来源，在神经疾病治疗领域已经日益得到重视。由于是单性生殖来源，因此在诱导分化的过程中仍存在很多问题。近年，在ES定向诱导分化的研究中，直接诱导分化法已经开始尝试，但在孤雌胚胎干细胞的诱导分化中还未见报道。本实验对小鼠孤雌胚胎干细胞向神经方向直接诱导进行了初步探索，结果表明，直接诱导法可以获得为数不少的前体细胞，并且进一步诱导出神经细胞。实验结果证实，不通过EB培养阶段,直接诱导形成神经细胞的方法适用于孤雌来源的胚胎干细胞。因本实验仅对诱导所得的细胞进行了形态学的鉴定，细胞的功能性检测还需进一步研究。
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