求助：小鼠BMSC冻存方法

xihuzi0217

  我以前用的小鼠骨髓间充质干细胞的冻存方法是 DMSO:FBS=1:9  ,4°C 30min  ,-20°C  过夜，-80°C 保存， 本想着短期会用到所以没有放到液氮中。
! z/ N' y: _6 d2 k) P1 O0 g- F但细胞复苏后基本全部死亡，求助高手，这种细胞如何冻存。  谢谢

267318024

我只能先跟你讲述一下我自己的冻存方法，FBS：DMEM：DMSO=5：4：1，即浓度为50%血清的冻存液，然后放到-80℃过夜，第二天转到液氮罐中，不过没有复苏，不知道细胞的状态，如果复苏了，我会跟进的。

若兰汀

说一下我的方法吧：事先配好20%-30%FBS的DMEM培养基，选取铺板90%以上的间充质干细胞（不要太满），50平方厘米培养瓶加1ml胰酶，消化一分钟（注意不能超过一分钟），拿吸管把胰酶吸出，加配好的培养基终止，一般3-5ml，吹匀细胞，加至冻存管，每管900ul，再加100ulDMSO，加完封口快速置于4度半小时，接着-20两小时，然后-80过夜，如果一个月内使用就放在-80即可，如果半年内使用放在液氮内。注意的几个点：培养基内FBS的含量可稍大但不是越大越好；消化时不要过度，会损伤细胞活力；消化后胰酶要弃去，有帖子称不弃胰酶复苏后贴壁能力差；冻存过程尽量避免震动冻存管；加冻存液后也快速转移到4度，据说DMSO在常温下对细胞由毒性。我的细胞复苏后，活力不错，24小时后可传代。

cc1986

学习啦

chuanbaozang

我觉得用FBS没什么问题，其浓度在10%-90%之间都可以，并且有人说浓度大点更好
6 [6 j7 j, D! P冻存过程中-20度时间太长了，我们一般选择4度30min，-20度1h，-80度过夜，然后迅速转移到液氮中，也可以在-80度多放几天。

xiaodiao123

我们也是：DMSO:FBS=1:9 ，4°C 30min ，20°C  1h，-80°C 过夜，然后转移到液氮中，细胞的成活率还不错哦。当然我们是先配制好冻存液放在4度保存，然后再进行冻存操作

267318024

我前天复苏了一批细胞，昨天去看了一下，状态相当好，跟我冻存前细胞是一样的，所以我觉得我之前描述的冻存方法应该是可靠的。
) |! Y' J, P+ X5 w复苏就比较简单了，从液氮罐中取出来后，放到小烧杯中，小烧杯内装水，量自己控制，水温在37摄氏度左右，然后拿个小镊子不停的搅拌，冻存管内容物完全液化后就可以装到25cm2的培养瓶中，基本上是一管装一瓶，然后加10ml培养基，我的是15%的胎牛血清的培养基，（Gibco公司），第二天就传代了。希望有用。

luoziwei

回复 若兰汀 的帖子$ y6 {# E  F' P1 v( O, u0 C, h! A

8 A  q% J3 Y: V6 G, w( ^* o- I请教，你吹打后不离心就直接分装在冻存管了？

luoziwei

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3 k6 p" ^1 a! v7 x# A' F; K. T4 Z/ j; f: q" w* D
第二天就传代了？

若兰汀

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: B8 e5 O8 T" J# p" K# k0 G$ S5 s% j. `1 @- t+ q$ E
是的