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求助:小鼠BMSC冻存方法   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2010-12-5 10:06 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
  我以前用的小鼠骨髓间充质干细胞的冻存方法是 DMSO:FBS=1:9  ,4°C 30min  ,-20°C  过夜,-80°C 保存, 本想着短期会用到所以没有放到液氮中。" V6 y# ?1 q6 {; j/ Y1 h, @4 j2 @
但细胞复苏后基本全部死亡,求助高手,这种细胞如何冻存。  谢谢
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沙发
发表于 2010-12-5 16:06 |只看该作者
我只能先跟你讲述一下我自己的冻存方法,FBS:DMEM:DMSO=5:4:1,即浓度为50%血清的冻存液,然后放到-80℃过夜,第二天转到液氮罐中,不过没有复苏,不知道细胞的状态,如果复苏了,我会跟进的。
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藤椅
发表于 2010-12-5 22:33 |只看该作者
说一下我的方法吧:事先配好20%-30%FBS的DMEM培养基,选取铺板90%以上的间充质干细胞(不要太满),50平方厘米培养瓶加1ml胰酶,消化一分钟(注意不能超过一分钟),拿吸管把胰酶吸出,加配好的培养基终止,一般3-5ml,吹匀细胞,加至冻存管,每管900ul,再加100ulDMSO,加完封口快速置于4度半小时,接着-20两小时,然后-80过夜,如果一个月内使用就放在-80即可,如果半年内使用放在液氮内。注意的几个点:培养基内FBS的含量可稍大但不是越大越好;消化时不要过度,会损伤细胞活力;消化后胰酶要弃去,有帖子称不弃胰酶复苏后贴壁能力差;冻存过程尽量避免震动冻存管;加冻存液后也快速转移到4度,据说DMSO在常温下对细胞由毒性。我的细胞复苏后,活力不错,24小时后可传代。
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板凳
发表于 2010-12-6 17:45 |只看该作者
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学习啦

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报纸
发表于 2010-12-7 11:28 |只看该作者
我觉得用FBS没什么问题,其浓度在10%-90%之间都可以,并且有人说浓度大点更好/ i  l  F% B1 I+ q* `1 r1 r
冻存过程中-20度时间太长了,我们一般选择4度30min,-20度1h,-80度过夜,然后迅速转移到液氮中,也可以在-80度多放几天。
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地板
发表于 2010-12-8 14:48 |只看该作者
我们也是:DMSO:FBS=1:9 ,4°C 30min ,20°C  1h,-80°C 过夜,然后转移到液氮中,细胞的成活率还不错哦。当然我们是先配制好冻存液放在4度保存,然后再进行冻存操作
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发表于 2010-12-24 09:13 |只看该作者
我前天复苏了一批细胞,昨天去看了一下,状态相当好,跟我冻存前细胞是一样的,所以我觉得我之前描述的冻存方法应该是可靠的。
% L* [- L# I+ ^/ H复苏就比较简单了,从液氮罐中取出来后,放到小烧杯中,小烧杯内装水,量自己控制,水温在37摄氏度左右,然后拿个小镊子不停的搅拌,冻存管内容物完全液化后就可以装到25cm2的培养瓶中,基本上是一管装一瓶,然后加10ml培养基,我的是15%的胎牛血清的培养基,(Gibco公司),第二天就传代了。希望有用。
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发表于 2010-12-24 09:58 |只看该作者
回复 若兰汀 的帖子
* {5 f1 e% ^3 B3 B; o7 S
4 w2 i/ X  T5 b9 o7 ^7 {请教,你吹打后不离心就直接分装在冻存管了?
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发表于 2010-12-24 09:59 |只看该作者
回复 267318024 的帖子
/ t/ F4 }. }6 d/ O- r3 z' K. ]* D! `1 b9 }
第二天就传代了?
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发表于 2010-12-24 11:54 |只看该作者
回复 luoziwei 的帖子
" n, x1 T4 M9 M' \" ^) G: ]' v  |) K8 x, Z; @; _
是的
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