左旋多巴对c17.2神经干细胞的毒性作用及培高利特的保护作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：刘卫国，陈生弟，汪锡金，陈琰，陆国强，梁梁，徐洁懿作者单位：200025上海交通大学附属瑞金医院神经科，帕金森病诊疗与研究中心（刘卫国，现在南京医科大学附属脑科医院神经内科） 4 Z6 y* l/ u, A' T/ e. e
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      , Q: o+ b- N6 M% l
      【摘要】  目的  探讨左旋多巴对c17.2神经干细胞的毒性作用和培高利特的保护作用。方法  c17.2神经干细胞加左旋多巴和培高利特培养不同时间，观察各组细胞的存活率、凋亡率和p53、Bax、Bcl2、核因子（NF）κB p65、细胞色素C、半胱氨酸蛋白酶（caspase3）和caspase3活性片段的表达。结果  左旋多巴可使c17.2神经干细胞活性降低，与剂量相关(均P4 G. |! C  a2 l! |& x$ j
      【关键词】左旋多巴；培高利特；c17.2神经干细胞；细胞凋亡；神经保护
   　　Cytotoxicity of Levodopa on c17.2 neural stem cell and neuroprotection of Pergolide

　　LIU Weiguo, CHEN Shengdi，WANG Xijin, et al.

　　Department of Neurology, Clinic & Research Center for Parkinsons Disease, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China
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　　Abstract：ObjectiveTo investigate the toxicity of Levodopa on c17.2 neural stem cell and neuroprotection of pergolide. Methodsc17.2 neural stem cells were cultured with Levodopa and pergolide for different time point, cell survival and apoptosis rates and expressions of p53，Bax, Bcl2, nuclear factor (NF)κB p65, Cytochrome C, caspase3 and the cleavage of caspase3 were measured.ResultsLevodopa induced a concentration and timedependent decrease of viability and proliferation in c17.2 neural stem cells (all P
% U! p! b8 P- m8 A" C

1 l; {" d  |; y6 S& A4 E2 p* S' c
　　Key words：Levodopa；Pergolide；c17.2 neural stem cell；apoptosis；neuroprotection: ]) @4 a5 p. }; ?: |9 |7 J
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　　近几年兴起的神经干细胞移植治疗帕金森病（PD）可能是颇具前景的治疗方法［1～3］。神经干细胞具有自我维持和更新、分裂增殖和多向分化的潜能，但与外科治疗方法类似，移植治疗后的PD患者仍需服用一定剂量的左旋多巴（LDopa）来控制症状。有研究［4］提示LDopa长期应用后可能会加重多巴胺能神经元的死亡。那么LDopa是否会对移植后的神经干细胞产生毒性作用？是否有促凋亡作用？如何预防？目前尚不清楚，这些都是神经干细胞移植治疗应用于临床后必须面对和努力解决的问题。本研究采用c17.2神经干细胞，加入LDopa和培高利特培养，观察两药物对细胞存活率和凋亡率的影响，以探讨LDopa的毒性作用和培高利特的拮抗作用。

　　1材料与方法6 I" d4 Y; O3 @6 i* {

　　1.1材料c17.2神经干细胞获赠于哈佛大学儿童医院Even Synder；LDopa（Sigma公司），培高利特（Sigma公司）；p53、Bax、Bcl2和细胞色素C（Santa Cruz Biotechnology, Inc.），半胱氨酸蛋白酶（caspase）3和caspase3活性片段抗体(Cell Signaling Technology)，核因子（NF）κB p65(Chemicon)；Brdu标记检测试剂盒（Roche公司），Annexin标记检测试剂盒（Roche公司）；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪及转膜装置（BIORAD，美国），流式细胞仪(Becton Dickinson, FAC Scalibur)。

　　1.2方法

　　1.2.1神经干细胞培养及处理将神经干细胞置于含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM（Gibco）高糖培养基中，加入100 mg/L氨基青霉素，100 mg/L链霉素，于37℃的CO2培养箱中培养。将培养瓶中的细胞按1105/ml传入培养板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。LDopa溶于0.01 N HCl中，同时加入50%维生素C以防止LDopa氧化，使用时再用培养液适当稀释。在不同培养孔加入50 μmol/L～1 mmol/L的LDopa，加入200 μmol/L LDopa （1～50） μg/ml的培高利特用于观察细胞的存活率。Brdu标记检测细胞增殖、AnnexinV染色荧光显微镜检测、AnnexinV染色流式细胞仪检测、Western Blot Bax、Bcl2、NFκBp65、细胞色素C、caspase3和caspase3活性片段检测分别设立正常对照组、200 μmol/L LDopa组（以下简称LDopa组）、200 μmol/L LDopa＋1 μg/ml 培高利特组（以下简称培高利特组）。! r3 a. O2 ]" j

　　1.2.2细胞存活率检测用唑盐比色法。培养细胞用磷酸缓冲液（PBS）洗2次，更换新鲜培养液，加20 μl MTT（5 mg/ml），37℃ 5%CO2培养4 h，弃培养液，加入200 μl二甲基砜(DMSO)，37℃孵育20 min，至颗粒溶解，在酶标仪（ELX800，BioTek Instruments）上测定570 nm处的吸光度(OD)。细胞存活率=（加药组OD-不加药细胞组OD）/（不加药对照组OD-不加药细胞组OD）100%。每一处理均做5个复孔。

　　1.2.3细胞增殖检测药物处理24 h后，使用 Brdu标记检测试剂盒进行检测，操作程序按照说明书进行。结果判定：细胞核呈棕褐色的为阳性细胞，高倍镜下（400）计数1000个细胞，统计阳性细胞数；阳性细胞指数=阳性细胞数/1000100%。, ?* z" H% f$ z

　　1.2.4凋亡细胞及凋亡细胞率检测凋亡细胞检测:药物分别处理12 h和24 h，培养细胞用PBS清洗2次，与AnnexinV＋碘化丙啶（PI）混合物（1∶1），室温反应15 min，荧光显微镜观察，激发光波长为450 nm，早期凋亡细胞为胞膜呈亮绿色荧光染色，晚期凋亡细胞为绿色荧光染色,细胞核被PI荧光染红。凋亡细胞率：培养细胞用PBS清洗1次，0.25%胰蛋白酶消化贴壁的c17.2神经干细胞约106，保留培养液终止反应，1000 r/min离心10 min，去上清液，细胞沉淀用100 μl PBS打匀，一分为二，实验组加入4 μl AnnexinV＋PI混合物（1∶1），正常对照组不加，室温反应15 min，上流式细胞仪检测。
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　　1.2.5Western Blot检测药物分别处理12 h和24 h，常规收集细胞，SDS Sample buffer(62.5 mmol/L TrisHCl, pH 6.8, 2% w/v SDS, 10%glycerol)裂解细胞，Bradford蛋白定量。取蛋白质20 μg， 14%Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，电转膜（80 mA，2 h），封闭1 h，分别加入Bax（兔抗小鼠）、Bcl2（小鼠抗小鼠）、NFκBp65(兔抗小鼠)、细胞色素C(山羊抗小鼠)、caspase3及其活性片段，caspase3多克隆抗体(兔抗小鼠)1∶1000，4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠、抗兔或抗山羊IgG (1∶2000)，室温孵育1 h后行化学发光法显示结果。% c! V% ?. ]- v8 a& Z* q

　　1.2.6统计学方法检测数据以均数±标准差(±s)表示，两组均数间比较用t检验。7 L) y" K4 {& H1 Z& N1 T
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　　2结果+ o% {  [3 B3 r( @; c9 b; J. C/ ^
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　　2.1不同浓度LDopa组、培高利特组细胞存活率比较见图1、2。当LDopa浓度为50 μmol/L和100 μmol/L时，细胞活性稍有增加，存活率为（119.85±20.36）%、（107.6±18.47）%;200 μmol/L时，细胞存活率出现明显下降［（73.02±13.12）%］，随着LDopa剂量［（400～1000）μmol/L］继续加大，细胞活性进一步降低，与对照组相比差异有统计学意义（均P
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　　2.2各组细胞增殖比较正常对照组、LDopa组及培高利特组经12 h、24 h、36 h的培养，Brdu标记检测显示，与正常对照组比较（图3A,棕褐色细胞为增殖期细胞），LDopa组（图3B）和培高利特组的细胞增殖均减少，培高利特组（图3C）的细胞增殖多于LDopa组。LDopa组及培高利特组12～36 h的细胞增殖阳性细胞指数均明显低于正常对照组（P% U. W3 T$ Y& z8 ?

　　2.3凋亡细胞及细胞凋亡率比较LDopa组12 h后即可发现早期凋亡细胞（图4A），24 h时凋亡细胞明显增多，并可见少量晚期凋亡细胞（图4B）；培高利特组24 h的晚期凋亡细胞较LDopa组少（图4C）。培养12 h后，LDopa组的细胞凋亡率为23.03%，培高利特组的细胞凋亡率为18.57%；24 h后，LDopa组的细胞凋亡率为34.14%，培高利特组为23.27%，培高利特组的细胞凋亡率明显低于LDopa组（均P
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　　2.4Western Blot检测结果培养6 h、12 h时LDopa组和培高利特组p53、Bax、细胞色素C表达量较正常对照组增加，24 h后下降，以上各时间点培高利特组表达量均低于LDopa组。6 h、12 h时LDopa组和培高利特组caspase3表达量较正常对照组明显增加，而caspase3活性片段未出现；24 h后，caspase3部分被切割为活性片段，LDopa组较培高利特组切割比例大。Bcl2、NFκB p65蛋白表达量在各时间点各组之间的变化不明显。

　　图1不同浓度LDopa对c17.2神经干细胞存活率的影响（略）

　　与对照组比较 aP
; m9 h3 q( I% W0 S8 [' p  ]
　　图2LDopa加不同浓度培高利特对c17.2神经干细胞存活率的影响（略）4 c! p; t- P: V7 h1 V3 B' @
+ {, K) l; X1 C, ]  s& N
　　与单用LDopa比较 aP0 k: e4 j; J# h3 }9 h- }$ f

　　图3Brdu标记检测（略）5 [6 G, v7 f6 F5 K

　　A：正常 c17.2神经干细胞; B：LDopa组细胞增殖减少; C：培高利特组细胞增殖多于LDopa组，但少于正常对照组

　　图4AnnexinV染色观察凋亡的c17.2神经干细胞（略）3 x. @9 N, n& b. i' t4 ^
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　　A：加入200 μmol/L Ldopa 12 h后的早期凋亡细胞; B：加入200 μmol/L Ldopa 24 h后凋亡细胞明显增多，并可见少量晚期凋亡细胞; C：培高利特组24 h后的晚期凋亡细胞较Ldopa组少
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　　3讨论: N/ {' B# }) Y- X) w+ G! j5 V3 Z

( ?$ W( w6 B  Y  K& o# j; P7 l

　　本研究采用源于小鼠原代小脑的c17.2神经干细胞，转入vmyc基因构建成永生化神经干细胞系，其具有多向分化潜能［5］。本研究发现当LDopa浓度为50 μmol/L时，细胞活性并没有下降；只有当浓度达到200 μmol/L时，细胞存活率才明显下降，且呈剂量依赖性。! `" F. K' c% Q% \5 l$ T
! d! o5 K' P( j

　　本实验运用Brdu标记检测细胞增殖，结果发现，随着200 μmol/L LDopa作用时间的延长，处于S期的细胞逐渐减少。表明LDopa的毒性作用具有时间依赖性，其毒性作用可能通过抑制细胞DNA的合成而实现。　　

　　AnnexinV是检测细胞凋亡早期的一个敏感而特异的方法［6］，早期凋亡细胞即可表现为膜被AnnexinV荧光染色，晚期凋亡细胞膜染色的同时核DNA被PI染色，死亡细胞仅核DNA被PI染色。本研究采用AnnexinV荧光染色，荧光显微镜下观察凋亡早期的c17.2神经干细胞的形态，并用流式细胞仪定量分析。结果发现：LDopa组12 h后可发现早期凋亡细胞，24 h后有相当数量的晚期凋亡细胞出现，表明较大剂量的LDopa对c17.2神经干细胞具有促凋亡作用。) B- R' D0 J& W2 M' y; r
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　　目前涉及LDopa毒性作用的研究多认为与氧化应激损伤机制有关［4,7,8］，氧化应激过度可引起线粒体功能障碍，促进细胞凋亡。因此，为进一步研究大剂量LDopa促凋亡作用的机制，本实验选择了凋亡通路中与线粒体途径有关的p53、Bax、Bcl2、细胞色素C、caspase3、caspase3活性片段和受体途径的NFκB p65进行了研究。结果发现LDopa组作用6 h、12 h后，p53、Bax、细胞色素C、caspase3表达量出现明显增加，24 h后p53、Bax、细胞色素C开始下降，而caspase3被切割为活性片段。各时间点Bcl2、NFκB p65表达没有明显变化。Bax是凋亡基因家族的核心成员之一，由p53直接激活，可提高凋亡敏感性，促进p53介导的细胞凋亡，Bcl2和Bax蛋白比例决定细胞存活或死亡［9］。细胞色素C位于Bax下游，作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，其存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf1 （apoptotic protease activating factor1）后启动caspase级联反应［10］。　　
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　　Caspases家族具有蛋白酶的生物学持性，是绝大多数细胞凋亡所必需的［9］。该家族成员中的caspases3是细胞凋亡中的关键蛋白酶［11］。过去，只把caspases3蛋白表达量增高作为检测凋亡的一项指标，实际上caspases3只有被切割为活性片段后才具有生物学功能。本研究发现LDopa作用6 h、12 h后caspases3表达量较正常增加，24 h后caspases3的活性片段明显增加，提示LDopa可能是通过caspases3途径而诱导c17.2神经干细胞的凋亡。　　7 A5 g) W5 L$ M: A
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　　本研究同时还检测了NFκB p65，没有发现明显变化。根据以上的研究结果可以看出大剂量LDopa的促凋亡作用与线粒体途径有关，并传递到下游的caspases3促进凋亡。( h; l; }+ k# g% `. X7 z

　　
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　　培高利特（一种D1、D2受体激动剂）临床上多用于有症状波动的PD患者使用LDopa的辅助治疗，近来被推荐作为早期PD患者的单药治疗，以延迟LDopa的使用。体外实验［12］证明，多巴胺受体激动剂通过刺激纹状体多巴胺D2受体抑制多巴胺的合成与释放，降低细胞外多巴胺浓度，以及减少氧自由基产生、抑制氧化应激反应，从而发挥对多巴胺能神经元的神经营养作用。有学者发现培高利特在体外能清除羟自由基和一氧化氮（NO），在体内能抑制脂质过氧化而发挥神经保护作用。本实验也证实小剂量培高利特可以部分拮抗LDopa对c17.2神经干细胞的毒性，促进DNA合成、细胞增殖，而且可以部分拮抗大剂量LDopa通过线粒体途径的促凋亡作用。提示对PD患者宜使用低、中剂量培高利特治疗，这不仅具有改善运动症状，而且可能具有延缓病情进展的作用。
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