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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:30 编辑
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6 d' \+ V. d0 m* K9 J1 A. x: O# d小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
$ i$ Z1 Z# p) D; x% L6 B' k( H% ?胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 - r* ~/ ^) B/ P0 \- I( q
/ N$ {. v* N% E2 a2 L; ~在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 1 }* [3 H0 r0 X
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 8 k Q* @- I/ y* `( x
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
, @% z9 S/ u* O& ?4 `% F) D根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
8 r, o0 r7 K& z- K7 g5 G滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 : M; w5 U5 f7 w3 }4 w6 L; N4 d
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
, H' N' w0 i+ }6 t( u$ b# j. }% }把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 : c" E+ t/ y5 v
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
# s& b8 g+ w9 F6 _去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 8 R( y/ m1 r6 C3 u# |
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 7 W$ }" P% `+ Z8 n; L$ Z
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 # o+ Y7 x1 j; r! Y6 R1 s8 p( G
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
) D; k% Q8 g0 {% I6 `! h! I/ Z把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
% }1 j# T- n2 Q2 L吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 9 L+ ~+ t7 O w# a9 N1 s
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 6 ^5 d% L0 A' N$ y2 ]6 |
小鼠胚胎干细胞的传代
# r2 X; g" Y4 W7 h' [( s吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
; ?: A* w+ B* O5 u2 C3 w+ x用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
5 _8 F2 [! p. N去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
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发表于 2011-2-15 19:17
